不同企業(yè)雷公藤多苷片的制劑質(zhì)量比較與評價△

汪祺，王亞丹，鄭笑為，文海若，馬雙成

中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

雷公藤為衛(wèi)矛科雷公藤屬植物，藥用部位多為其干燥根[1]。其具有祛風除濕、活血通絡、殺蟲解毒等功效，臨床應用范圍較廣，適應癥包括類風濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、紅斑狼瘡及器官移植后作為免疫抑制劑使用[2-5]。雷公藤主要化學成分包括萜類，其中對二萜成分雷公藤甲素和三萜成分雷公藤紅素藥理研究較多，其被認為是雷公藤的主要藥效成分；此外，雷公藤還含有倍半萜生物堿、倍半萜多醇酯及木脂素等[6-13]。隨著雷公藤制劑的廣泛使用，其臨床不良反應及毒性逐漸凸顯，主要表現(xiàn)為肝、腎毒性、血液系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)損害。有研究顯示，雷公藤甲素及雷公藤紅素為其主要藥效及毒性成分[14-15]。有研究針對不同廠家雷公藤多苷片制劑進行了指紋圖譜及小鼠體內(nèi)抗炎藥效、毒性比較研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，7個廠家的雷公藤多苷片化學成分差異顯著，同時抗炎藥效及肝腎毒性方面也存在較大差異。因此控制制劑質(zhì)量，使其發(fā)揮藥效的同時避免不良反應發(fā)生成為雷公藤制劑質(zhì)控亟待解決的問題[16]。

本研究依托國家藥品評價抽驗工作，對全部雷公藤多苷片現(xiàn)行生產(chǎn)企業(yè)進行抽樣測定，共涉及10個企業(yè)171批次樣品，實驗采取標準檢驗與探索性研究相結(jié)合的方法，首先對雷公藤多苷片質(zhì)量進行整體評價，并發(fā)現(xiàn)該品種存在的問題；其次進行體外毒性實驗，對制劑中含量較高的單體成分進行肝毒性考察，旨在為進一步完善該制劑安全性標準提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料

1.1 儀器

Waters 2695-2996 PDA型液相色譜系統(tǒng)；薄層色譜自動點樣儀(卡瑪公司)；ZBS-6E型智能崩解試驗儀(天津市精拓儀器科技有限公司)；VICTOR X5型多功能酶標儀(PerkinElmer)。

1.2 試藥

雷公藤甲素對照品(批號：111567-201404，純度：99.8%)、雷公藤紅素對照品(批號：111946-201501，純度：97.0%)、雷公藤內(nèi)酯甲對照品(批號：111597-200505，純度：100%)購自中國食品藥品檢定研究院；對琨B(純度>98%)為中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所贈送；雷公藤次堿(批號：PL0078，純度≥98.5%)、雷公藤春堿(批號：PL0077，純度≥98.5%)、雷公藤晉堿(批號：PL0080，純度≥99%)購自成都普利斯生物科技有限公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，Sigma)；RPMI 1640培養(yǎng)基(Hyclone)；1%青鏈霉素混合液(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；胰蛋白酶-EDTA消化液(Life Technologies)；胎牛血清(FBS,Gibco)；細胞增殖-毒性檢測試劑盒/CCK-8(日本同仁化學研究所)；中性氧化鋁(Agela Technologies，200目)；雷公藤多苷片(來自10個企業(yè)共171批次，企業(yè)分別用A～J代表)；乙酸乙酯(分析純，北京化學試劑廠)；乙腈、甲醇均為色譜純(Fisher公司)。

2 方法

2.1 崩解時限考察

按《中華人民共和國藥典》2015年版一部附錄Ⅻ A 崩解時限檢查法測定171批次雷公藤多苷片崩解時間，標準規(guī)定供試品應在1 h內(nèi)全部崩解。

2.2 薄層鑒別

參照國家藥品監(jiān)督管理局頒標準(WS3-B-3350-98-2011)項下雷公藤內(nèi)酯甲薄層檢查，制備質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的雷公藤內(nèi)酯甲對照品溶液。供試品溶液制備方法詳見標準。以環(huán)己烷-丙酮(5∶3)為展開劑展開，10%硫酸乙醇溶液顯色，105 ℃加熱至斑點顯色清晰[17]。

2.3 雷公藤甲素檢查

取雷公藤甲素適量，精密稱定，加甲醇制成0.05 mg·mL-1的對照品溶液；供試品溶液同[雷公藤內(nèi)酯甲含量測定]項下供試品溶液制備方法，分別精密吸取對照品及供試品溶液各10 μL測定，以甲醇-水(43∶57)為流動相，檢測波長為218 nm[17]。

2.4 雷公藤內(nèi)酯甲含量測定

參照國家藥品監(jiān)督管理局頒標準(WS3-B-3350-98-2011)項下雷公藤內(nèi)酯甲含量測定項，取雷公藤內(nèi)酯甲適量，甲醇溶解配制每1 mL含0.1 mg的對照品溶液；供試品溶液制備方法：雷公藤多苷片乙酸乙酯提取后經(jīng)中性氧化鋁處理，收集洗脫液，最終定容至5 mL量瓶。取對照品及供試品溶液各10 μL測定，以甲醇-乙腈-水(64∶16∶20)為流動相，檢測波長為210 nm[17]。

2.5 體外肝細胞毒性研究

將HepaRG細胞接種于75 mL培養(yǎng)瓶內(nèi)，以RPMI 1640完全培養(yǎng)基(含10%FBS和1%青鏈霉素混合液)于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)基隔天更換，細胞貼壁生長，覆蓋瓶底80%～90%時，用胰蛋白酶-EDTA消化液消化，并調(diào)整細胞密度為1×105個/mL。在96孔板中接種細胞懸液，每孔100 μL，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細胞貼壁后更換含不同濃度藥物的培養(yǎng)液。雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯甲給藥濃度分別為5、10、20、40、80、160、320 nmol·L-1，雷公藤紅素給藥濃度分別為0.15、0.3、0.6、1.2、2.4、4.8、9.6 μmol·L-1，對琨B給藥濃度分別為2.5、5、10、20、40、80、160 μmol·L-1，雷公藤春堿、雷公藤次堿、雷公藤晉堿給藥濃度均分別為5、10、20、40、80、160、320 μmol·L-1，每個濃度設3個復孔，同時設0.5%DMSO作為溶媒對照，設不含細胞的培養(yǎng)基作為空白對照。給藥后在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h，向每孔加入10 μL CCK-8溶液后在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h，用酶標儀測定450 nm處的吸光度值并計算細胞存活率。

(1)

3 結(jié)果

3.1 崩解時限檢查結(jié)果

按標準檢驗所有樣品崩解時限(1 h)均符合規(guī)定，但不同企業(yè)間崩解時間差異顯著，部分企業(yè)樣品崩解時間不足1 min，而導致崩解時間差異顯著的主要原因為制劑工藝不統(tǒng)一。結(jié)果見表1。

表1 10個不同企業(yè)來源的雷公藤多苷片的崩解時間

3.2 薄層鑒別檢查結(jié)果

按標準進行薄層檢查(見圖1)，171批次樣品均可檢出雷公藤內(nèi)酯甲相對應斑點，但現(xiàn)行標準中對照品配制濃度與樣品中雷公藤內(nèi)酯甲實際含量相差較大，建議調(diào)整該標準中對照品使用濃度。

注：1～8、10～20.10個企業(yè)中隨機抽取樣品各1個批次；9.雷公藤內(nèi)酯甲對照品。圖1 雷公藤多苷片薄層鑒別

3.3 雷公藤甲素檢查結(jié)果

10個企業(yè)隨機抽取1個批次樣品進行測定，結(jié)果見圖2。液相色譜圖顯示，不同企業(yè)間雷公藤多苷片所含化學成分存在明顯差異；此外通過對171批次樣品測定發(fā)現(xiàn)(見表2、圖2)，雖然10個企業(yè)雷公藤甲素含量均符合標準規(guī)定，每片含雷公藤甲素不超過10 μg，但不同企業(yè)及相同企業(yè)不同批次間，雷公藤甲素含量差異顯著，部分企業(yè)甚至未檢出雷公藤甲素。提示，作為已被證明為藥效成分的雷公藤甲素除規(guī)定上限外，同時應對含量下限進行明確規(guī)定。

注：10個企業(yè)隨機取1批進行測定。圖2 雷公藤多苷片中雷公藤甲素液相色譜圖

表2 10個不同企業(yè)來源的雷公藤多苷片中的雷公藤甲素含量

3.4 雷公藤內(nèi)酯甲含量測定結(jié)果

10個企業(yè)隨機抽取1批次樣品進行測定，結(jié)果見圖3、表3。液相色譜圖顯示，不同企業(yè)間雷公藤多苷片所含成分存在明顯差異。通過對171批次樣品測定發(fā)現(xiàn)，10個企業(yè)雷公藤內(nèi)酯甲含量均符合標準規(guī)定，每片含雷公藤內(nèi)酯甲不少于10 μg，然而不同企業(yè)間，雷公藤內(nèi)酯甲含量11～62 μg/片，同一企業(yè)不同批次間含量19～62 μg/片，可見質(zhì)控指標雷公藤內(nèi)酯甲含量波動范圍大，存在產(chǎn)品質(zhì)量整體不穩(wěn)定的情況。

注：10個企業(yè)隨機取1批進行測定。圖3 雷公藤多苷片中雷公藤內(nèi)酯甲液相色譜圖

表3 10個企業(yè)雷公藤多苷片中雷公藤內(nèi)酯甲含量情況

3.5 體外細胞毒性評價

雷公藤多苷片現(xiàn)行標準控制的指標成分主要為雷公藤內(nèi)酯甲及雷公藤甲素，10個企業(yè)171批次樣品中雷公藤內(nèi)酯甲含量范圍分布差異較大，而已有明確毒性報道的雷公藤甲素在制劑中含量普遍較低，部分企業(yè)甚至不含雷公藤甲素，因此提示雷公藤多苷片不良反應的原因是否為其他成分導致。查閱文獻發(fā)現(xiàn)，雷公藤多苷片中雷公藤紅素也具有藥效作用且含量較高，此外生物堿類成分約占其總提取物的30%，而此類成分以往研究較少，因此針對這一類含量高或具有藥效作用的成分進行體外細胞毒性考察，可初步推測其潛在毒性風險，為形成制劑質(zhì)量標準提供數(shù)據(jù)支持。實驗選取雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯甲、雷公藤紅素、對琨B及具有結(jié)構(gòu)代表性的生物堿雷公藤春堿、雷公藤次堿、雷公藤晉堿進行體外毒性考察。

實驗結(jié)果以細胞存活率及半數(shù)抑制濃度(IC50)值為評價指標，考察待測單體的潛在毒性作用，結(jié)果見圖4、表4。分析數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，雷公藤甲素(IC50為0.015 μmol·L-1)及對琨B(IC50為0.10 μmol·L-1)毒性強，雷公藤紅素(IC50為5.73 μmol·L-1)次之，4個生物堿單體成分幾乎沒有毒性作用，因此提示，除雷公藤甲素外，應增加制劑中對琨B及雷公藤紅素的含量限度控制。相反，生物堿類成分含量高，無明顯毒性作用，因此其是否具有藥效作用值得進一步研究。

注：a.雷公藤甲素；b.雷公藤紅素；c.雷公藤內(nèi)酯甲；d.雷公藤春堿；e.雷公藤次堿；f.雷公藤晉堿；g.對琨B。圖4 雷公藤藥材不同單體體外細胞毒性實驗

表4 雷公藤藥材中不同單體的體外細胞毒性結(jié)果 μmol·L-1

4 討論與結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤多苷片制劑不同企業(yè)及相同企業(yè)不同批次間樣品崩解時限差異大，雷公藤甲素及雷公藤內(nèi)酯甲含量相差懸殊，雷公藤內(nèi)酯甲含量測定結(jié)果顯示，該成分含量11～62 μg/片，提示該產(chǎn)品整體質(zhì)量不穩(wěn)定。

目前，雷公藤多苷片制劑原料均由制劑廠家自行制備，無統(tǒng)一生產(chǎn)工藝，制備雷公藤總苷涉及柱層析環(huán)節(jié)，而吸附劑用量、洗脫溶劑、組分收集等方面各企業(yè)不盡相同，由此導致制劑崩解時間相差懸殊，化學成分含量相差較大，在臨床上則表現(xiàn)為療效和毒副作用的差異。現(xiàn)代藥理研究表明，不同生產(chǎn)企業(yè)雷公藤多苷片制劑在抗炎藥效方面不同[16]。此外，6個不同企業(yè)雷公藤多苷片小鼠肝毒性研究發(fā)現(xiàn)，不同企業(yè)生產(chǎn)的雷公藤多苷片，對于小鼠肝系數(shù)、血清生化及肝組織中丙二醛(MDA)值影響作用差異顯著，提示質(zhì)量差異與其臨床不良反應也具有明顯相關(guān)性[18]。因此控制制劑質(zhì)量，使其發(fā)揮藥效的同時避免不良反應發(fā)生成為雷公藤制劑質(zhì)控亟待解決的問題。提高雷公藤多苷片制劑質(zhì)量，首先要統(tǒng)一該制劑生產(chǎn)工藝，其次建立合理的質(zhì)量標準。本研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤多苷片現(xiàn)行標準存在如下問題：薄層鑒別與含量測定項重復設定，且薄層鑒別對照品溶液濃度與制劑中雷公藤內(nèi)酯甲含量差異大，不利于實驗結(jié)果判定；雷公藤甲素含量檢查僅設置上限，而部分企業(yè)樣品未檢出該成分，因此建議增加下限檢查。其次，針對其不良反應的發(fā)生，本研究體外毒性實驗發(fā)現(xiàn)，對琨B及雷公藤紅素為潛在毒性成分，含量較高的生物堿可能為一類毒性低同時具有藥效的活性成分，因此建議進一步考察其藥效并增設控制指標。