基于UPLC含量測定的不同廠家穿心蓮膠囊質(zhì)量評(píng)價(jià)

趙振霞，蘇建，孔亞萍，劉永利

河北省藥品檢驗(yàn)研究院，石家莊 050011

穿心蓮膠囊是由穿心蓮單味藥制成的中成藥，具有清熱解毒、涼血消腫的功效，是臨床常用清熱解毒用藥，主要用于咽喉腫痛、口舌生瘡等[1]。穿心蓮主要有效成分為穿心蓮內(nèi)酯(andrographolide，AP)、脫水穿心蓮內(nèi)酯(dehyandrographolide，DAP)、去氧穿心蓮內(nèi)酯和新穿心蓮內(nèi)酯等二萜內(nèi)酯類成分，其中AP和DAP含量較高，在解熱消炎、抗腫瘤等方面具有較強(qiáng)的藥理作用[2-4]。全國穿心蓮膠囊的生產(chǎn)企業(yè)共有28家，此次依托國家藥品評(píng)價(jià)抽驗(yàn)，在全國藥品生產(chǎn)、經(jīng)營、使用單位共抽取了27批樣品，涉及4個(gè)生產(chǎn)企業(yè)，基本覆蓋了目前市場上主流產(chǎn)品。本研究采用超高效液相色譜法(UPLC)，建立了同時(shí)測定穿心蓮膠囊中AP與DAP含量的方法，對(duì)27批穿心蓮膠囊樣品的含量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了穿心蓮膠囊的主要質(zhì)量問題，為藥品生產(chǎn)企業(yè)改進(jìn)質(zhì)量與完善質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

超高效液相色譜儀(配備四元泵、DAD 檢測器，美國 Waters 公司)；AE240型電子分析天平(瑞士METTLER TOLEDO 公司)；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；超純水儀(美國Millipore 公司)。

1.2 試藥

AP對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110797-201609，純度：99.7%)；DAP對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110854-201509，純度：99.4%)；穿心蓮膠囊樣品抽自全國藥品生產(chǎn)、經(jīng)營、使用單位；甲醇、乙腈(色譜純，Merck，Germany)；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱選用ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；以乙腈為流動(dòng)相A，水為流動(dòng)相B，梯度洗脫(0～5 min，10%～15%A；5～15 min，15%～22%A；15～20 min，22%～25%A；20～30 min，25%～35%A)；柱溫：30 ℃，流速：0.3 mL·min-1；檢測波長：225 nm(AP)、254 nm(DAP)。

2.2 溶液的制備

2.2.1混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取AP對(duì)照品、DAP對(duì)照品10.45、10.90 mg，分別置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度分別為0.208 4、0.216 7 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.2.2供試品溶液的制備 取裝量差異項(xiàng)下的本品，研細(xì)，取約1粒的量，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3陰性樣品溶液的制備 取穿心蓮膠囊陰性樣品粉末適量(按處方及工藝，制備不含穿心蓮的陰性樣品)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

精密量取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，在該色譜條件下，AP和DAP與相鄰成分均可達(dá)到較好的分離，分離度>1.5，理論板數(shù)以AP峰計(jì)不低于5000，且陰性無干擾，說明系統(tǒng)適用性良好，見圖1。

注：1.AP；2.DAP。圖1 穿心蓮膠囊專屬性UPLC圖

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1線性關(guān)系考察 依次精密量取不同濃度的AP對(duì)照品溶液與DAP對(duì)照品溶液2 μL，分別注入超高效液相色譜儀，按2.1項(xiàng)下色譜條件測定，以對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程。結(jié)果表明，AP在0.082 6～2.064 8 μg呈良好的線性關(guān)系，回歸方程：Y=7.863×106X+6.103×104(r=0.999 9)；DAP在0.040 8～1.019 7 μg呈良好的線性關(guān)系，回歸方程：Y=6.239×106X+5.327×104(r=0.999 9)。

2.4.2穩(wěn)定性試驗(yàn) 取按2.2項(xiàng)下制備的同一份穿心蓮膠囊供試品溶液，照2.1項(xiàng)下的色譜條件分別在0、1、2、4、8、16、24 h進(jìn)樣測定，記錄峰面積，AP和DAP峰面積的RSD分別為0.85%、1.24%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批穿心蓮膠囊樣品，研細(xì)，取0.15、0.30、0.45 g，各3份，精密稱定，分別按2.2項(xiàng)下制備方法制備供試品溶液，照2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測定，記錄各成分峰面積，計(jì)算得到AP和DAP的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為46.64、17.99 mg·g-1，RSD分別為1.1%、1.6%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的穿心蓮膠囊樣品約0.15 g，共9份，分別加入低、中、高3個(gè)濃度的混合對(duì)照品溶液，按2.2項(xiàng)下制備方法制備供試品溶液，照2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率及其RSD，結(jié)果見表1，表明該方法回收率較好。

表1 穿心蓮膠囊中AP與DAP加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.5 樣品測定

精密吸取按2.2項(xiàng)下方法制備的穿心蓮膠囊供試品溶液，照2.1項(xiàng)下的色譜條件依次進(jìn)樣測定，按外標(biāo)法計(jì)算各樣品中AP和DAP的含量，結(jié)果見表2，不同生產(chǎn)企業(yè)之間測定結(jié)果比較的箱式圖見圖2。

表2 穿心蓮膠囊中AP與DAP的含量測定結(jié)果 mg/粒

含量測定結(jié)果顯示，27批穿心蓮膠囊樣品中，AP與DAP的含量分別為0.94～7.50、5.62～10.12 mg/粒。箱式圖顯示，不同生產(chǎn)企業(yè)之間DAP的含量相差較小，測定結(jié)果較為集中；而AP的含量相差懸殊，部分樣品的測定結(jié)果較低；表明生產(chǎn)企業(yè)在生產(chǎn)中未關(guān)注AP含量，只關(guān)注了法定標(biāo)準(zhǔn)中測定的DAP含量。另外，各企業(yè)樣品都是DAP含量>AP含量，與藥材中兩者含量相反[5-7]，可能與藥材質(zhì)量、生產(chǎn)工藝等有關(guān)。

AP聚類分析(見圖3)顯示，廣西千珍制藥有限公司的樣品單獨(dú)聚為一類，說明與其他企業(yè)之間存在明顯差異，從測定結(jié)果也可以看出廣西千珍制藥有限公司的樣品含量測定值比其他企業(yè)要高；DAP聚類分析結(jié)果顯示，各企業(yè)不同批次之間樣品含量測定結(jié)果都有交叉，說明企業(yè)之間的差異性較小。

圖2 穿心蓮膠囊中AP與DAP的含量測定結(jié)果

注：A.AP;B.DAP；使用平均聯(lián)接(組間)的樹狀圖重新調(diào)整距離聚類合并。圖3 穿心蓮膠囊含量測定聚類分析結(jié)果

3 討論

3.1 提取條件的選擇

在前期實(shí)驗(yàn)中考察了回流提取法和超聲提取法對(duì)樣品中AP和DAP提取量的影響。結(jié)果表明，回流和超聲對(duì)兩者的提取量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且超聲提取法簡單、方便，故確定超聲提取法為樣品提取方法。還對(duì)40%甲醇、60%甲醇、80%甲醇和甲醇等不同提取溶劑進(jìn)行考察，結(jié)果表明，采用甲醇為溶劑提取效果最好。

3.2 檢測波長的選擇

采用紫外全波長光譜掃描得到AP最大吸收波長在225 nm處，DAP最大吸收波長在254 nm處，選用其中任意一個(gè)波長，另一組分響應(yīng)值都較低，因此選定雙波長法對(duì)樣品進(jìn)行測定。

3.3 樣品質(zhì)量評(píng)價(jià)

中成藥是通過整體作用而發(fā)揮療效，因此生產(chǎn)中需盡可能關(guān)注所有成分的變化情況，而不是僅僅關(guān)注質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中測定的指標(biāo)成分。此次樣品測定結(jié)果表明，企業(yè)只關(guān)注了法定標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的DAP含量，未關(guān)注AP含量，而AP穩(wěn)定性較差，在提取過程中易降解[8]，文獻(xiàn)報(bào)道通過合適的工藝參數(shù)可有效提高AP的轉(zhuǎn)移率[9-10]，因此企業(yè)需優(yōu)化工藝參數(shù)，保證AP與DAP的轉(zhuǎn)移率。

3.4 意義

鑒于中藥的特殊性，采用何種方法對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，是目前行業(yè)內(nèi)亟須解決的關(guān)鍵問題[11-12]。雖然多成分的含量測定技術(shù)并不足以對(duì)產(chǎn)品不同批次質(zhì)量的一致性進(jìn)行科學(xué)全面的評(píng)價(jià)，但在實(shí)際生產(chǎn)過程中，廠家可以通過對(duì)這2種主要成分含量變化的關(guān)注，快速、科學(xué)地評(píng)價(jià)產(chǎn)品質(zhì)量。另外，本研究對(duì)穿心蓮膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高也具有重要意義。