LC-MS技術在天然產物黃酮類成分分析中的應用△

牛江濤，曹瑞，司昕蕾，辛二旦，張育貴，張淑娟，李越峰*

1.甘肅中醫藥大學 藥學院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中藥質量與標準研究重點實驗室，甘肅 蘭州 730000

黃酮類化合物(flavonoids)是廣泛存在于自然界，基本母核為2-苯基色原酮(C6-C3-C6)的一系列化合物的總稱[1]。黃酮類成分是多種中藥的次生代謝產物，也是其主要的藥效成分[2-3]。研究表明，黃酮類化合物具有保護心血管系統[4-7]、抗氧化[8]、抗抑郁[9]、抗炎[10]、抗腫瘤[11]、鎮靜催眠[12]等作用，并有類雌激素[13]作用。黃酮類化合物分布廣泛、數量眾多且結構復雜，因此選用一種高效、快速、準確的結構鑒定和含量測定的分析技術具有重要的意義。液質聯用(LC-MS)技術是近年來發展起來的集LC的高分離能力和MS的高靈敏度及強大的結構測定能力于一體的一門綜合性分析技術[14]，近年來已經越來越廣泛地應用于黃酮類成分的分析測定中。本文通過對LC-MS技術在黃酮類成分研究中應用的相關文獻進行綜述和歸納，旨在為黃酮類成分的分析測定提供參考。

1 LC-MS技術概述及化合物分析方法

1.1 LC-MS簡述

液質聯用儀主要由高效液相色譜、接口設備以及質譜3個部分組成，接口設備將LC和MS精密地結合，使得LC-MS可以同時對復雜成分進行定性和定量分析[15]。LC-MS技術的主要原理是樣品先經過液相色譜分離后進入接口設備，使樣品氣化、電離并除去流動相溶劑，最后進入質譜儀做質譜檢測。接口技術是LC-MS的關鍵技術，目前應用最廣泛的接口技術主要是大氣壓離子化接口(API)技術，其主要包括電噴霧離子化(ESI)、大氣壓化學離子化(APCI)和離子噴霧離子化(ISI)模式[16]。隨著技術的不斷更新，LC-MS技術不僅能檢測小分子物質還能檢測如蛋白質、多肽等大分子物質，同時還可以分析極性大、揮發性差和熱不穩定的化合物[15]。因此，LC-MS技術在藥物分析、質量控制、藥代動力學、代謝組學、蛋白組學等諸多領域有著廣泛的應用[17]。

1.2 LC-MS化合物分析方法

樣品經前處理后，進入液相色譜，經分離后，洗脫進入質譜離子源，實現樣品離子化，然后進入質譜檢測器中按照母離子質荷比(m/z)差異進行分離選擇，然后進入碰撞室發生碰撞誘導裂解，產生子離子，再經后1個質量分析器按m/z分離后檢測，從而實現定性定量分析[18]。例如基于超高效液相色譜聯合飛行時間串聯質譜(UPLC-Q-TOF/MS)技術結合數據依賴型掃描模式，能夠獲得成分高質量精度的一級質譜和二級質譜信息。依據化合物的一級質譜信息(相對保留時間、準離子峰質荷比以及對應的加合離子)能夠確定化合物的分子式，通過檢索NISI、Wiley等數據庫，可以從中篩選出目標化合物[19]；再結合化合物的二級質譜信息進一步確定化合物的母核結構、特征官能團等，從而快速篩選或推測出目標化合物結構。

2 黃酮類化合物結構特征和裂解規律

2.1 結構特征

黃酮類化合物是由2個苯環(A與 B環)通過3個碳原子互相聯結而成的一系列化合物。通常根據中間3個碳原子是否成環、環與環的接連位置以及三碳的氧化程度等結構特征，常將黃酮類化合物分成黃酮(flavone)、異黃酮(isoflavone)、黃酮醇(flavonol)、二氫黃酮(flavanone)、二氫異黃酮(isoflavanone)、二氫黃酮醇(flavanonol)、查耳酮(chalcone)、花色素(anthocyanidin)等[20-21]。黃酮類化合物的基本母核結構見圖1。

圖1 黃酮和異黃酮母核結構

自然界中存在的天然黃酮大多是以上述結構為母核的衍生物，因A、B環上取代基的數目、種類、取代位點的不同而形成各種各樣的黃酮類物質，常見的取代基有羥基、甲基、甲氧基及異戊烯基等[22]。黃酮類化合物主要以2種形式存在于植物體內，其中大部分以與糖基結合成苷的形式存在，而另一部分以游離形式存在。天然黃酮糖苷多以O-糖苷和C-糖苷形式存在。

2.2 裂解規律

近年來，學者們對黃酮類化合物做了大量的質譜研究。研究表明，ESI和APCI模式均適用于黃酮類化合物分析，一般正離子模式下稍好于負離子模式[23]。電噴霧質譜等軟電離質譜技術，不但可以得到游離黃酮類的強分子離子峰，并且可以直接測定黃酮類O-糖苷，而獲得很強的分子離子峰或準分子離子峰，同時也能獲得有關苷元及糖基部分的重要結構信息[24]。研究表明，黃酮類化合物均發生系列以C環為中心的斷裂、丟失與重排反應，其主要有如圖2所示的2種裂解方式。

裂解方式Ⅰ(RDA裂解)：

裂解方式Ⅱ：

圖2 黃酮類化合物主要裂解方式

上述2種裂解方式呈相互競爭、互相制約的關系[24]。大多數游離黃酮的分子離子峰[M]+為基峰，[M-H]+、[M-CO]+以及由裂解方式I產生的碎片A1+、[A1-CO]+和B1+峰均為較重要的峰，此類質譜信息可以確定苷元類型及A、B、C環上的取代基類型及取代基數目[25]。黃酮苷類因與糖基連接的苷鍵原子為C原子和O原子的不同而分為黃酮C-糖苷和黃酮O-糖苷。黃酮C-糖苷多以糖環的交叉環切除裂解為主，幾乎不產生苷元離子；黃酮O-糖苷的裂解以糖苷鍵的斷裂、糖糖鍵的斷裂以及糖環的交叉環切除裂解為主[23]。研究表明，在質譜分析中結構相同的化合物一般其裂解規律相似并具有相似的特征碎片，因而總結黃酮標準物質的裂解規律，并以其特征碎片離子作為診斷離子，有利于黃酮類未知化合物的質譜解析[26]。

3 LC-MS技術在黃酮類成分分析中的應用

3.1 LC-MS技術在黃酮類成分結構分析中的應用

LC-MS技術可以得到樣品的紫外圖譜、正負模式下的總離子流圖以及各組分的一級、二級質譜圖，通過與對照品相對保留時間的比對及準分子離子峰、特征碎片離子峰信息的綜合分析，可以解析化合物結構信息。黨立志等[27]采用 LC-MS技術，以迷迭香為研究藥材，建立了一種快速識別其中黃酮苷類化合物的方法，同時解析出了14 種黃酮苷及其同系物結構。王翌臣等[28]基于LC-MS技術從大狼把草的提取液中鑒定出了22個黃酮類成分，并發現其裂解方式主要是丟失CO和H2O等碎片。王蘆笛[29]采用多離子監測-信息依賴-增強型子離子掃描(MIM-IDA-EPI)掃描方式為主，LTQ/Orbitrap mass分析為輔的分析方法對瑞香狼毒水提液進行分析，并鑒定出23種黃酮類化合物。白海玉等[30]基于前級離子質量準確度、同位素分布模式和碰撞誘導解離(CID)碎裂模式等分析，同時結合二級譜圖信息匹配及文獻報道，從野菊花中共鑒定出28種黃酮類成分的結構。馮藝飛等[31]基于LC-MS技術對茵陳黃酮提取物組成進行分析，并從中鑒定出了蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷等成分。Cao等[32]基于高效液相色譜-電噴霧電離子串聯離子阱質譜(HPLC-ESI-IT-MSn)技術從紫花地丁中成功鑒定出了35種黃酮苷類成分結構。

3.2 LC-MS技術在黃酮類成分定量分析中的應用

LC-MS技術以其高靈敏性可以測定極少量樣品中成分的含量。謝進等[33]采用LC-MS對黃秋葵莢果中黃芩素、柚皮素、槲皮素、黃芩苷和蘆丁5種黃酮類成分的含量進行測定，并發現該方法具有重復性好、靈敏度高、專一性強等優點。杜娟等[34]采用LC-MS技術，以體積分數為0.1%甲酸乙腈和體積分數為0.1%甲酸水溶液為流動相，在負離子模式下采用多反應監測，測定葛根素、木犀草素、槲皮素和兒茶素含量。其研究結果表明，4 種黃酮的平均加樣回收率為93.6%～107.5%，RSD為1.62%～2.21%，表明該方法靈敏、準確、穩定，可用于山楂降脂軟膠囊的質量控制。魏巍等[35]采用UPLC-MS/MS同時測定了鎮江香醋中10種黃酮類成分含量，結果表明，10種黃酮類化合物在25.0～1 000.0 ng·mL-1線性關系良好(0.999 8≥r≥0.993 4)，檢出限為1.0～4.0 ng·mL-1。朱雅玲等[36]基于HPLC-MS/MS同時測定了喘可治注射液中4種黃酮苷含量，其研究結果顯示，4種成分在API3000液質聯用系統儀上的定量限均為 0.04 ng·mL-1、檢測限均為 0.05 ng·mL-1。

3.3 LC-MS技術在黃酮類成分藥動學研究中的應用

近年來，LC-MS技術越來越多地應用到黃酮類成分的藥代動力學研究中。有研究采用HPLC-MS/MS，同時測定了灌胃大薊提取物后大鼠血漿中7種黃酮類成分的含量，并發現其中除芹菜素外，6種大薊黃酮類成分在大鼠體內吸收和消除迅速[37]。常路[38]采用LC-MS對槐角中槐角苷、染料木苷、染料木素、蘆丁、槲皮素和山柰酚6種黃酮類成分做了藥代動力學研究，其研究結果顯示，灌胃給藥槐角提取物后黃酮苷先被吸收，黃酮苷元后被吸收，且黃酮苷元在血液中消除緩慢。另有研究采用LC-MS做了麥冬中黃烷酮E、麥冬黃酮A、麥冬二氫黃烷酮A和麥冬二氫黃烷酮B大鼠血漿中的藥物動力學研究，結果表明，麥冬黃酮類成分雖具有相似的化學結構，但血藥濃度-時間曲線和藥物代謝動力學參數卻表現出顯著差異[39]。

4 結語

黃酮類化合物廣泛存在于植物體內，具有多種藥理活性，是一類具有廣泛開發前景的天然藥物。因此，總結梳理黃酮類化合物的快速準確的定性定量分析方法，對其進一步開發研究具有重要意義。LC-MS技術集液相色譜高分離能力和質譜的結構解析能力于一體，具有高靈敏度、高分辨率、快速、穩定等特點，是黃酮類等復雜化合物同時定性定量分析的重要技術手段。隨著LC-MS技術的不斷發展，采用該技術分析黃酮類化合物將會變得更加快速、準確、簡單和便捷。