茶樹花青素生物合成研究中“組學(xué)”及相關(guān)生物技術(shù)的應(yīng)用分析

李慧麗

摘 要：茶是一種重要的全球性經(jīng)濟(jì)作物，由其芽葉制作而成的飲品是“世界三大飲料之一”，其含有多種有益于人體健康的次生代謝物，如兒茶素、茶氨酸、有機(jī)酸等。紫葉茶樹品種的發(fā)現(xiàn)，具抗氧化功效的花青素成為茶葉天然活性成分，使茶葉的保健功效更上一層。花青素作為植物中最大的一類水溶性天然色素，在果蔬、花卉中大量存在，其代謝途徑已被深入研究。由于茶葉高花青素品種近年來才陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，所以對茶樹中花青素的生物合成途徑研究仍相對滯后。近年來，越來越多的研究運(yùn)用“組學(xué)”技術(shù)配合其他生物技術(shù)來分離鑒定茶樹中調(diào)控花青素合成的結(jié)構(gòu)基因以及轉(zhuǎn)錄因子，雖有所獲，但要完全揭示茶樹中花青素代謝的分子機(jī)制還需深入研究。該文介紹了茶樹花青素的測定技術(shù)，闡述了“組學(xué)”及相關(guān)生物技術(shù)在茶樹花青素生物合成中的研究應(yīng)用進(jìn)展，以期為今后的深入研究提供參考。

關(guān)鍵詞：茶樹花青素;生物合成;生物技術(shù)

中圖分類號 S571 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號 1007-7731（2020）20-0026-03

The Application of Omics and Related Biotechnology in Anthocyanin Biosynthesis

LI Huili

（Sichuan Agricultural University， Chengdu 611130， China）

Abstract：Tea is an important global economic crop.The beverage made from its buds and leaves is“one of the three major beverages in the world”.It contains many beneficial secondary metabolites， such as catechin， theanine and organic acid.The discovery of purple tea leaves makes the anthocyanin， which has antioxidant effect，become the natural active ingredient of tea leaves，and further enhances the health care effect of tea leaves.As the largest water-soluble natural pigment in plants，anthocyanin is abundant in fruits，vegetables and flowers，and its metabolic pathway

has been deeply studied.As the varieties with high anthocyanin content in tea leaves have been discovered in recent years，the research on the biosynthetic pathway of anthocyanin in tea trees is still relatively backward.In recent years，more and more studies have applied “omics” technology and other biological technologies to isolate and identify structural genes and transcription factors that regulate anthocyanin synthesis in tea plants.Although some gains have been made，further studies are needed to fully reveal the molecular mechanism of anthocyanin metabolism in tea plants.In order to provide reference for further research，the determination technology of anthocyanin in tea was introduced， and the research and application progress of “omics” and related biotechnology in the biosynthesis of anthocyanin in tea was described in this papaer.

Key words：Anthocyanin of tea tree;Biosynthesis;Biotechnology

1 茶樹花青素測定技術(shù)

測定茶樹中花青素及其組分，是探究茶樹花青素代謝的基礎(chǔ)，花青素含量作為可量化的性狀指標(biāo)，往往比葉色更加直觀、準(zhǔn)確，用于作為代謝途徑中結(jié)構(gòu)基因及轉(zhuǎn)錄因子差異表達(dá)的反映指標(biāo)是科學(xué)且具體的。針對花青素總量的測定，對比Sun，B.[1]等年與李健[2]方法，他們選擇的材料均為茶樹品種“紫鵑”（前者源于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶園，后者源于福建省農(nóng)科院茶研所），前者采用單次浸提、放置過夜的方法，后者則采用短時(shí)、多次浸提的方法;且兩者提取緩沖液的選擇與花青素總量吸光度的計(jì)算方法均不同，前者僅測定A353（花青素）與A650（葉綠素），而后者測定量為A350（花青素）、A620（可溶性糖）、A650（葉綠素），后者更好地排除了可溶性糖的影響，查閱資料發(fā)現(xiàn)，大部分研究選擇的是后者Zheng and Tian[3]文獻(xiàn)中的測定方法。

針對花青素組分的測定，對比Sun，B.[1]等與Kang Wei[4]等方法，所選材料仍均為“紫鵑”（后者源于杭州的TRICAAS實(shí)驗(yàn)茶園），前者采用高效液相色譜法（HPLC）分析出樣品中主要含有此2種花色苷（cyanidin-3-O-galactoside與delphinidin-3-O-galactoside），后者則采用高效液相色譜聯(lián)合質(zhì)譜分析（LC-MS）分析，并增加矢車菊色素-3-O-半乳糖苷作為內(nèi)參，分離出4種主要花青素（除上述2種，增加delphinidin-3-O-b-D-（6-（E）-p-coumaroyl）galactopyranosidecyanidin-3-O-b-D-（6-（E）-p-coumaroyl）galactopyranoside）。可發(fā)現(xiàn)得益于高效液相色譜與質(zhì)譜技術(shù)的愈加成熟和更多標(biāo)準(zhǔn)樣的分離及合成，花青素組分的鑒定更加全面。

2 cDNA提取及轉(zhuǎn)錄本獲得與注釋

當(dāng)下探究花青素代謝途徑分子機(jī)制的主流方式是提取茶樹cDNA并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。近年來，除測序技術(shù)更新?lián)Q代，茶樹“舒茶早”全基因組測序的完成，也為茶樹轉(zhuǎn)錄組測序以及進(jìn)行SSR標(biāo)記等提供了更精準(zhǔn)的參考。對比Sun，B.[1]等、He，X.[5]等以及Wei Kang[4]等提取cDNA以及轉(zhuǎn)錄組測序的方法，其不同點(diǎn)主要在于試劑盒、測序公司的選擇，測序深度以及對比數(shù)據(jù)庫的不同上，得出的結(jié)論也隨之呈現(xiàn)傾向性，但得益于茶樹中類黃酮途徑越來越多的結(jié)構(gòu)基因序列被測定，如Lai，Y.S.[6]等所發(fā)表文獻(xiàn)中展示的紫茶品種“紫嫣”類黃酮合成途徑中高質(zhì)量的CHS，CHI，F(xiàn)3H，F(xiàn)LS，F(xiàn)3′H，F(xiàn)3′5′H，DFR，ANS，LAR and ANR等基因的全長序列，使得對轉(zhuǎn)錄本所獲差異基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果更準(zhǔn)確。

3 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建與應(yīng)用

根據(jù)差異表達(dá)基因系統(tǒng)進(jìn)化樹同源性分析鎖定目的基因。對比Sun，B.[1]等、Kang Wei[4]等與He，X.[5]等的研究，其均采用ClustalX執(zhí)行多個(gè)序列比對，通過鄰接法利用分子進(jìn)化遺傳學(xué)分析軟件MEGA構(gòu)建進(jìn)化樹，其唯一不同是使用的MEGA版本分別為7.0、6.0、5.0。自MEGA軟件問世，26年里共更新8個(gè)版本，最新版為MEGA X，其更新主要在于功能的增刪和計(jì)算方式的優(yōu)化，如MEGA4的2大新特征——采用圖形圖例格式以提供自然語言描述的模型和方法以便在分析中使用，以及提出Maximum Composite Likelihood（MCL）方法（用于同時(shí)評估所有序列對之間的進(jìn)化距離;同時(shí)考慮或不考慮位點(diǎn)之間的速率變化和譜系之間的替代模式異質(zhì)性;在不知情的情況下估計(jì)轉(zhuǎn)移/轉(zhuǎn)位偏倚和核苷酸替代模式）[7];而MEGA 5則優(yōu)化了MCL方法，選擇最適合的替代模型（核苷酸或氨基酸），推斷祖先狀態(tài)和序列（以及概率），以及每個(gè)位點(diǎn)估計(jì)進(jìn)化率，且在計(jì)算效率、準(zhǔn)確性、替代參數(shù)和站點(diǎn)間的速率變化方面得到提升[8];MEGA 7則推出了64位版本，能分析更大的數(shù)據(jù)集;MEGA X則支持多計(jì)算平臺(tái)，能夠在Windows和Linux操作系統(tǒng)上跨平臺(tái)使用，并能使用多個(gè)計(jì)算核心進(jìn)行多分子進(jìn)化分析[9]。根據(jù)構(gòu)建進(jìn)化樹的需求不同，不同領(lǐng)域?qū)Π姹镜倪x用也具傾向性，例如在微生物分析中最常用的是MEGA2.0。

4 亞細(xì)胞定位

亞細(xì)胞定位是指某種蛋白或表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的具體存在部位，其意義在于為預(yù)測蛋白質(zhì)功能提供有用線索以及推測蛋白質(zhì)行使功能的模式，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)只有處于特定的細(xì)胞環(huán)境才能正常發(fā)揮作用。對比Sun，B.[1]等與Kang Wei[4]等方法，發(fā)現(xiàn)兩者雖均使用“GFP融合蛋白表達(dá)法”對目的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行亞細(xì)胞定位，但后者在方法上有所精進(jìn)，除使用GFP熒光蛋白外，還增加了水稻金屬轉(zhuǎn)運(yùn)體Nrat1和鋅指轉(zhuǎn)錄因子ART1與紅色熒光蛋白（RFP）融合作為參考定位標(biāo)記（Nrat1定位于細(xì)胞膜，ART1表達(dá)于細(xì)胞核），這比僅用GFP熒光蛋白載體浸染作空白對照，更加清晰。查閱近年來關(guān)于茶樹花青素生物合成的文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)大部分都未使用亞細(xì)胞定位技術(shù)來作相應(yīng)研究，即使使用也是如上文提到的兩者，僅作的是目的蛋白在細(xì)胞中表達(dá)位置的淺顯研究。目前蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位的預(yù)測方法早已發(fā)展到對多信息融合利用進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能注解的程度，相較于簡單定位，其融合氨基酸的進(jìn)化保守信息及位置特異性得分矩陣信息，以及蛋白質(zhì)共有序列信息與基因本體論信息，來選取蛋白質(zhì)特征信息并進(jìn)行GO注釋，同時(shí)結(jié)合氨基酸的物化性質(zhì)，對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分割重組、功能進(jìn)行對比推測。

5 結(jié)構(gòu)基因與轉(zhuǎn)錄因子的互作研究

在對顯著差異表達(dá)的蛋白進(jìn)行分離、定位后，為對其功能及調(diào)控機(jī)制進(jìn)行更深入研究，往往會(huì)根據(jù)前人研究尋找其作用綁定位點(diǎn)，再對差異表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行序列分析，看其是否包含有差異表達(dá)蛋白作用的位點(diǎn)元素，來初步確定此結(jié)構(gòu)基因與差異表達(dá)蛋白的互作。常用的方法有酵母單雜交試驗(yàn)[1]、農(nóng)桿菌滲透（GUS測定）法[4]等。其原理都是分離結(jié)構(gòu)基因的啟動(dòng)子與差異表達(dá)蛋白的基因，并將它們搭載到含有報(bào)告基因的載體上，檢查報(bào)告基因的表達(dá)來驗(yàn)證其是否相互作用。后者由于最終是轉(zhuǎn)到模式植物中進(jìn)行表達(dá)，應(yīng)作空白對照，排除模式植物內(nèi)源基因的影響;而前者目前通用的系統(tǒng)有GAL4系統(tǒng)與LexA系統(tǒng)，其中由于LexA系統(tǒng)中的BD（結(jié)合功能域）來源于原核生物，在真核生物內(nèi)缺少同源性，因此可減少假陽性的出現(xiàn)。

關(guān)于轉(zhuǎn)錄因子間相互作用的研究，目前較為常用的方法是酵母雙雜交試驗(yàn)，并采用雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）法進(jìn)行驗(yàn)證。前者可用于判斷轉(zhuǎn)錄因子負(fù)責(zé)相互作用的結(jié)構(gòu)域，且所有操作均是在核酸水平上進(jìn)行，無需純化大量蛋白，可精確地測定蛋白之間的“弱”相互作用;后者用于輔助試驗(yàn)，可觀察到轉(zhuǎn)錄因子互作發(fā)生的位置、強(qiáng)弱（熒光信號強(qiáng)弱來判斷）、所形成蛋白質(zhì)復(fù)合體的穩(wěn)定性等，若進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測，還可觀察到蛋白質(zhì)互作發(fā)生的時(shí)間。

6 目的基因的功能鑒定

由于茶樹高多酚含量致使茶樹遺傳轉(zhuǎn)化體系建立過程中存在轉(zhuǎn)化效率低和離體再生困難的問題，現(xiàn)雖有多種改良技術(shù)，可優(yōu)化茶樹遺傳體系的建立，但距離可直接在茶樹中鑒定、表達(dá)功能基因，仍需作大量工作。目前，對于目的基因的功能鑒定主要采用的方法是煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化、擬南芥的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化以及基因沉默等。比較Sun，B.[1]等與He，X。[5]等所用的煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法，前者是將融合到35S啟動(dòng)子上的目的基因插入到根癌農(nóng)桿菌進(jìn)行瞬時(shí)測定，并分離成功表達(dá)的菌株克隆到相應(yīng)載體上，用無針頭針管浸染煙草葉片;后者的方法更為精進(jìn)，其對重組菌株的選擇采用菌落PCR鑒定法（鑒定出一個(gè)含有各靶標(biāo)結(jié)構(gòu)的單菌落），并用葉盤法對煙草進(jìn)行轉(zhuǎn)化，可更好地排除外源基因的干擾，減少假陽性情況的發(fā)生。除以上兩種方法外，茶樹基因沉默法也可用于功能基因的鑒定，如通過轉(zhuǎn)錄后沉默咖啡因合酶mRNA獲得低咖啡因茶，但其要求已對功能基因的結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制充分挖掘。

7 結(jié)語

當(dāng)前，“組學(xué)”技術(shù)已廣泛應(yīng)用于茶樹花青素代謝途徑研究中，但相較于其他經(jīng)濟(jì)作物仍滯后，處于摸索、模仿階段。研究中采用的生物技術(shù)手段也較落后，停留在該技術(shù)使用的初級階段，如對亞細(xì)胞定位技術(shù)的使用，僅停留在定位階段，而對其衍生出來的蛋白功能注釋未充分利用。對于花青素總量及組分的測定技術(shù)已十分成熟，對茶樹花青素代謝途徑差異表達(dá)基因的注釋、分離得益于“舒茶早”全基因組序列的測定也較為精準(zhǔn)，更多的問題在于基因或蛋白的功能鑒定，由于茶樹遺傳體系建立尚未完善，功能鑒定僅能從模式植物中獲得“可能”結(jié)論，對分離鑒定出的基因能實(shí)際助力于產(chǎn)業(yè)發(fā)展還有很長的路要走。

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