葡萄糖氧化酶和嗜酸乳桿菌與小檗堿配伍對大腸桿菌生長的抑制作用

陳景巖 耿啟泉 常娟 王平 尹清強 劉超齊 李茂龍 朱群 盧富山

摘要 為了獲得抗生素的最佳替代品，采用單因素和多因素設計開展了葡萄糖氧化酶（GOD）和嗜酸乳桿菌與小檗堿（BBR）配伍對大腸桿菌生長抑制作用的研究。單因素試驗結果表明，葡萄糖氧化酶、嗜酸乳桿菌、小檗堿和金霉素均對大腸桿菌生長有顯著的抑制作用 （P<0.05），并且隨著濃度的增加其抑制作用逐步增強。多因素試驗結果表明，選取 0.005 0%GOD和1×105 CFU/mL嗜酸乳桿菌與 0.001 5%BBR組合對大腸桿菌的抑制作用與75～150 mg/kg金霉素的抑菌作用相當。通過該研究獲得了一種新的抗生素替代品，為畜產品安全生產提供了保障。

關鍵詞 葡萄糖氧化酶;嗜酸乳桿菌;小檗堿;金霉素;抑菌作用

中圖分類號 S816.7? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）20-0095-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.20.026

Inhibition Effects of Glucose Oxidase and Lactobacillus acidophilus and Berberine on the Proliferation of Escherichia coli

CHEN Jing-yan1，GENG Qi-quan2，CHANG Juan1 et al （1.College of Animal Science & Technology，Henan Agricultural University，Zhengzhou，Henan 450046;2.Weihui Agricultural and Rural Bureau of Henan Province，Weihui，Henan 453100）

Abstract In order to obtain the optimal substitute of antibiotics，the inhibition effects of combination of glucose oxidase （GOD） and Lactobacillus acidophilus with berberine （BBR）? on the growth of Escherichia coli were studied by single-factor and multi-factor experiments.The results of single-factor experiment showed that GOD，L.acidophilus，BBR and aureomycin individually had significant inhibitory effects on the proliferation of E.coli （P<0.05）， and the antibacterial activity gradually increased with increasing of their concentrations.The multi-factor experiments showed that the combination of 0.005 0% GOD，1×105 CFU/mL L.acidophilus and 0.001 5% BBR had the same inhibitory effect on E.coli growth with 75-150 mg/kg aureomycin.A new antibiotic substitute was obtained，which provided guarantee for the safe production of livestock products.

Key words Glucose oxidase;Lactobacillus acidophilus;Berberine;Aureomycin;Antibacterial activity

20世紀50年代我國就開始使用抗生素類飼料添加劑來提高動物的生產性能，但抗生素產生的濫用會導致動物腸胃功能紊亂，并產生抗藥、耐藥、二重感染以及體內殘留等問題，給畜禽生產帶來了巨大的威脅。因而，尋找可代替抗生素類的飼料添加劑勢在必行 [1]。嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）是一種能在動物腸道內定殖的益生菌，其耐酸性和抗逆性強，是腸道內重要的益生菌。嗜酸乳桿菌具有調節機體腸道菌群平衡、抑制腸道病原微生物生長、提高機體免疫力等作用，已經被廣泛應用于畜禽生產中 [2-4]。

葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）是一種需氧脫氫酶，能專一氧化β-D-葡萄糖為葡萄糖酸和過氧化氫，并在此過程中消耗O2。目前，葡萄糖氧化酶已被廣泛應用于食品、醫藥等領域。據報道，葡萄糖氧化酶具有抑菌、促進動物生長作用，且無毒、無抗藥性，是一種替代抗生素的新型添加劑，具有廣闊的應用前景 [5]。

小檗堿（berberine，BBR）是從黃連根莖中提取的異喹林生物堿，是我國傳統中藥之一。小檗堿具有顯著的抑菌作用，臨床上主要作為非處方藥，用于治療胃腸道炎癥和細菌性痢疾 [6]。由于單一因素的抑菌作用所需劑量大、效果差、成本高，所以研究低濃度嗜酸乳桿菌和葡萄糖氧化酶與小檗堿配伍對大腸桿菌（Escherichia coli）生長的抑制作用，對于抗生素替代品的研制具有重要意義。筆者采用單因素和多因素設計開展了葡萄糖氧化酶（GOD）和嗜酸乳桿菌與小檗堿（BBR）配伍對大腸桿菌生長抑制作用的研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 試驗所用大腸桿菌和嗜酸乳桿菌均由河南農業大學生物技術與動物營養研究實驗室保存。小檗堿（純度99%）和葡萄糖氧化酶（10 000 U/g）由河南德鄰生物制品有限公司提供，鹽酸金霉素（純度90%）由福建浦城正大生化有限公司提供。

1.2 培養基 ①LB培養基：胰蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH為7.0～7.2，在121 ℃、0.15 MPa條件下高壓滅菌20 min，4 ℃下保存備用。②MRS培養基：胰蛋白胨20 g，酵母浸粉10 g，葡萄糖20 g，吐溫80? 1 mL，磷酸氫二鉀 2 g，無水乙酸鈉5 g，檸檬酸銨2 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH為6.2～6.6，在 121 ℃、0.15 MPa條件下高壓滅菌20 min，4 ℃下保存備用。③伊紅美藍培養基（北京奧博星生物技術有限責任公司）：稱取42.5 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH為（7.2±0.2），在121 ℃、0.15 MPa條件下高壓滅菌20 min，備用。

1.3 菌種活化、計數與母液配制

將大腸桿菌接種到LB培養基中，37 ℃、180 r/min搖床培養24 h后按照2% 接種量接入新鮮的LB培養基中，再于37 ℃、180 r/min搖床培養24 h后測定活菌數，置于4 ℃冰箱中保存備用。將嗜酸乳桿菌接種到MRS培養基中，37 ℃恒溫培養箱中靜止培養24 h后按照2%的接種量接入新鮮MRS培養基中，37 ℃恒溫培養箱中靜止培養24 h后測定活菌數，4 ℃下保存備用。分別將BBR、GOD、金霉素配制成0.03%、2.50%、0.15%的母液，用濾膜過濾除菌后4 ℃下保存備用。

1.4 試驗方法

1.4.1 不同濃度GOD對大腸桿菌生長的抑制作用。利用已配制好的GOD母液，分別配制成GOD終濃度為0、 0.005 0%、0.012 5%、0.025 0%的 LB培養液100 mL，按照1%的接種量接入大腸桿菌，37 ℃、180 r/min搖床培養24 h，分別在8、16、24 h對培養液進行取樣，每組每個時間點9個重復。用伊紅美藍培養基計算大腸桿菌數量（CFU/mL），用常用對數表示。

1.4.2 不同活菌數嗜酸乳桿菌對大腸桿菌生長的抑制作用。將已經計數好的嗜酸乳桿菌分別稀釋成最終活菌數為0、1×105、 1×106、1×107 CFU/mL的MRS培養液，將大腸桿菌按照1%的接種量接入含有不同活菌數嗜酸乳桿菌的100 mL MRS培養液中， 37 ℃、60 r/min搖床培養24 h，其他處理同“1.4.1”。

1.4.3 不同濃度BBR對大腸桿菌生長的抑制作用。將預先配制好的小檗堿母液配制成終濃度為0、0.001 5%、 0.003 0%、0.006 0%、0.009 0%的MRS 培養液100 mL，在 121 ℃、 0.15 MPa條件下高壓滅菌20 min后，按照1%接種量接入大腸桿菌菌液，37 ℃、180 r/min搖床培養24 h，其他處理同“1.4.1”。

1.4.4 GOD與嗜酸乳桿菌組合對大腸桿菌生長的抑制作用。分別配制含0.005 0%GOD的不同活菌數嗜酸乳桿菌（0、1×105、1×106、1×107 CFU/mL）的100 mL MRS培養液，按照1%的接種量接入大腸桿菌， 37 ℃、搖床中60 r/min培養24 h，其他處理同“1.4.1”。

1.4.5 GOD、BBR和嗜酸乳桿菌組合對大腸桿菌生長的抑制作用。分別配制含有0.005 0%GOD和0.001 5%小檗堿及不同活菌數嗜酸乳桿菌（0、1×105、1×106、1×107 CFU/mL）的MRS培養液100 mL，按照1%的接種量接入大腸桿菌，? 37 ℃、 60 r/min 搖床培養24 h，其他處理同“1.4.1”。

1.4.6 GOD和BBR與嗜酸乳桿菌的不同組合以及不同濃度的金霉素對大腸桿菌生長的抑制作用。配制含0.005 0%GOD、0.001 5%BBR和1×105 CFU/ml嗜酸乳桿菌的MRS培養液100 mL，配制金霉素有效含量分別為37.50、75.00、 150.00 mg/kg的MRS培養液100 mL，分別按照1%的接種量接入大腸桿菌，并以100 mL MRS培養液接入1%大腸桿菌作為對照組，在37 ℃、轉速60 r/min的條件下搖床培養24 h，其他處理同“1.4.1”。

1.5 數據統計與分析

采用SPSS 17.0統計軟件對所有數據進行處理，采用方差分析進行顯著性檢驗，結果均以“平均數±標準差”表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同濃度GOD對大腸桿菌生長的抑制作用

由表1可知，僅添加2%葡萄糖對大腸桿菌生長有一定的抑制作用（P<0.05）。在僅添加單一GOD時，對大腸桿菌生長不具有抑制作用（P>0.05），而只能在有葡萄糖共同作用下才有抑制大腸桿菌生長的作用（P<0.05），且隨著GOD濃度的增加和作用時間的延長對大腸桿菌生長的抑制作用逐漸增強 （P<0.05）。

2.4 GOD與不同活菌數嗜酸乳桿菌組合對大腸桿菌生長的抑制作用

由表4可知，0.005 0%GOD與不同活菌數的嗜酸乳桿菌組合對大腸桿菌具有顯著的抑制作用（P<0.05），并且隨著嗜酸乳桿菌活菌數的增加和作用時間的延長，抑制大腸桿菌的作用逐漸增強（P<0.05）。這初步證實了低濃度GOD 與不同活菌數嗜酸乳桿菌組合的抑菌效果與高濃度GOD相當，并具有較好的協同抑菌作用。

2.5 GOD和BBR與不同活菌數的嗜酸乳桿菌組合對大腸桿菌生長的抑制作用

從表5可以看出，0.005 0%GOD和0001 5%BBR與不同活菌數嗜酸乳桿菌組合具有明顯抑制大腸桿菌生長的作用（P<0.05）。與單一因素或雙因素組合結果相比，低濃度的三因素組合的抑菌作用更強。

2.6 GOD和BBR與嗜酸乳桿菌的不同組合以及不同濃度金霉素對大腸桿菌生長的抑制作用

由表6可知，低濃度GOD、BBR與嗜酸乳桿菌兩兩組合或者三者組合以及不同濃度的金霉素對大腸桿菌均具有明顯的抑制作用 （P<0.05）。其中，三因素組合的抑菌作用最強，與150.00 mg/kg金霉素的抑菌效果相當。另外，GOD與嗜酸乳桿菌雙因素組合的抑菌作用效果，與75.00 mg/kg金霉素的抑菌效果相當。

3 討論與結論

3.1 單一BBR、GOD和嗜酸乳桿菌的抑菌功能

小檗堿具有抑菌、抗腫瘤、抗氧化、抗痢疾等藥理作用 [7]，通過建立人工感染沙門氏菌小鼠體內模型發現小檗堿可以抑制小鼠體內革蘭氏陰性菌，并可延長細菌感染小鼠的存活時間及降低細菌感染小鼠的死亡率 [8]。借助人工建立大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌懸浮液體外模型，結果表明小檗堿具有抑制大腸桿菌（抑菌率93.96%）、金黃色葡萄球菌（抑菌率41.88%）、白色念珠菌（抑菌率34.28%）的作用 [9]，這與該研究結果相吻合。小檗堿的抑菌機理包括抑制菌體分裂、核酸復制、致病性和蛋白酶活性，與腸道菌群相互作用，并對胃腸道黏膜具有保護作用等 [7]。

葡萄糖氧化酶是一種需氧脫氫酶，能專一性氧化葡萄糖生成葡萄糖酸和過氧化氫。由于氧氣的消耗抑制了需氧菌的生長，有利于厭氧益生菌的生長，形成微生態競爭優勢，從而抑制大腸桿菌、沙門氏菌等有害菌的存活，所產生的過氧化氫具有殺菌作用 [10]。該研究結果表明，GOD能夠顯著改善動物腸道微生態平衡以及腸道消化環境，保護腸道健康，提高飼料的利用率，促進動物的生長和增強動物機體抗病力，是一種綠色、安全、高效、對人體無毒副作用的飼料添加劑 [11]。楊久仙等 [12]研究表明日糧中添加0.2%和0.3%GOD可以顯著降低仔豬胃和回腸的大腸桿菌數量，增加仔豬胃和回腸內乳酸菌數量。湯海鷗等 [13]開展了GOD體外抑菌試驗，結果表明GOD對大腸桿菌和沙門氏菌生長具有明顯的抑制效果。該研究結果表明，低劑量的GOD也表現出較好的抑制大腸桿菌生長的作用。

嗜酸乳桿菌是一種微生態制劑，屬于乳酸菌家族的成員，可在腸道中定殖，具有改善和調節腸道微生物菌群平衡、抑制病原微生物生長、增強機體免疫力及抑制腫瘤細胞的形成等功能 [14-15]。Sartor [2]報道用嗜酸乳桿菌對137例急性腹瀉患者進行治療，結果表明口服嗜酸乳桿菌制劑24 h后，82%的患者腹瀉次數明顯減少，糞便稠度也有改善;治療 72 h 后，所有患者排便次數和糞便稠度恢復正常。該研究結果表明，單一的嗜酸乳桿菌具有較強的抑制大腸桿菌生長的作用，且隨著嗜酸乳桿菌數量的增多，其抑菌效果逐漸增強，是一種較好的抗生素替代品。

3.2 GOD、BBR與嗜酸乳桿菌組合對大腸桿菌的抑制作 用

雖然單一GOD、BBR和嗜酸乳桿菌都具有良好的抑制大腸桿菌生長作用，但使用劑量均較高，這在生產成本和實際應用中都受到一定的限制。另外，GOD、BBR和嗜酸乳桿菌這3種產品均有各自的優勢。如何發揮三者的協同作用，對于研制高效的抗生素替代品具有重要意義。

GOD可以催化葡萄糖生成葡萄糖酸，改善胃腸道酸性消化環境，當與嗜酸乳桿菌配合可在腸道內發揮酸化劑和微生態制劑的雙重作用，可使胃腸道內pH降低，抑制大腸桿菌的生長和繁殖，促進益生菌的增殖 [16]。趙國先等 [17]研究表明，在日糧中添加 GOD能不同程度降低回腸和空腸pH，但對胃和十二指腸中pH卻無顯著影響;同時，GOD 還具有明顯抑制大腸桿菌生長、促進盲腸中乳酸桿菌和雙歧桿菌增殖的作用。嗜酸乳桿菌屬于腸道中乳桿菌屬，同時也是腸道中的益生菌類，產酸能力強，與GOD配伍可以起到協同抑制大腸桿菌的作用。

Wang 等 [18]報道BBR通過減少腸道菌產生ATP和NADH，起到抑菌作用。Zhang 等 [19]報道小檗堿能夠增加具有短鏈脂肪酸產生功能的 Blautia 和 Allobaculum 等菌屬數量，調節腸道pH，抑制大腸桿菌的生長和繁殖。據報道，益生菌和中藥提取物配伍使用通常比二者單一使用具有更強的抗菌作用 [20-21]，充分證實了BBR與益生菌協同抑制大腸桿菌生長的有效性，與該研究結果相一致。

GOD與益生菌配伍以及益生菌與BBR配伍的協同抑菌作用已有相關報道，但GOD、嗜酸乳桿菌、BBR三者協同對大腸桿菌生長的抑制作用尚未見報道。該研究結果表明，低濃度葡萄糖氧化酶和低濃度嗜酸乳桿菌與低濃度小檗堿配伍，其抑菌作用與75～150 mg/kg金霉素相當，充分證實了三者配伍對抑制大腸桿菌生長和繁殖的有效性和疊加性，為抗生素替代及畜產品安全生產提供了一種新的飼料添加劑。

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