響應(yīng)面法優(yōu)化川澤瀉發(fā)汗工藝

羅騫昀 羅昕怡 張亞琴 文秋姝 鄧秋林 陳興福

摘要 [目的]用響應(yīng)面法優(yōu)化澤瀉發(fā)汗加工工藝。[方法]通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)分轉(zhuǎn)換，以發(fā)汗?jié)蔀a的浸出物含量、23乙酰澤瀉醇B和24乙酰澤瀉醇A含量的綜合評(píng)分為考察指標(biāo)，分別探究環(huán)境溫度、發(fā)汗時(shí)間和含水量對(duì)綜合評(píng)分的影響，在單因素試驗(yàn)確定的優(yōu)化范圍基礎(chǔ)上，采用3因子二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)的響應(yīng)面法優(yōu)化了川澤瀉的發(fā)汗工藝。[結(jié)果]川澤瀉發(fā)汗的最佳工藝條件是環(huán)境溫度45 ℃、發(fā)汗時(shí)間94 h、含水量10%，此條件下綜合評(píng)分為94.02±0.02，浸出物含量為（15.34±0.02）%，23乙酰澤瀉醇B含量為（0.06± 0.02）mg/mL，24乙酰澤瀉醇A含量為（0.02±0.01）mg/mL。[結(jié)論]該研究建立的澤瀉最佳發(fā)汗工藝能夠提高澤瀉質(zhì)量，為川澤瀉的開發(fā)和利用提供可靠方法。

關(guān)鍵詞 川澤瀉;發(fā)汗工藝;響應(yīng)面法;工藝優(yōu)化;綜合評(píng)分

中圖分類號(hào) R284? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2020）20-0180-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.20.048

Optimization of Diaphoretic Processing of Alisma orientalis by Response Surface Methodology

LUO Qian-yun，LUO Xin-yi，ZHANG Ya-qin et al

（College of Agriculture， Sichuan Agricultural University，Wenjiang，Sichuan 611130）

Abstract [Objective]To optimize the diaphoretic processing of Alisma orientalis by response surface methodology.[Method]Through the conversion of standard scores， the comprehensive scores of the extract content， Alisol B 23 acetate and Alisol A 24 acetate were used as the investigation indicators， and the effects of environmental temperature， diaphoretic time and water content on the comprehensive score were explored respectively.Based on the optimization range determined by the single factor experiment， the diaphoretic processing of Alisma orientalis was optimized using the response surface method of the three-factor quadratic regression orthogonal rotation combination design.[Result]The best diaphoretic processing of Alisma orientalis were environmental temperature 45 ℃，diaphoretic time 94 h， and water content 10%. Under this condition， the comprehensive score was 94.02±0.02， the extract content was （15.34±0.02）%， and Alisol B 23 acetate was （0.06±0.02） mg/mL and Alisol A 24 acetate was （0.02±0.01） mg/mL. [Conclusion ]The best diaphoretic processing method established on this experiment could increase the quality of Alisma orientalis，providing reliable method for the expansion of the market.

Key words Alisma orientalis（Sam.）Juzep.;Diaphoretic processing;Response surface methodology;Processing optimization;Comprehensive grade

澤瀉科植物澤瀉Alisma orientalis（Sam.）Juzep.的干燥塊莖為常用大宗藥材。現(xiàn)代藥理研究表明，澤瀉具有利尿、降血脂、降血糖、抗炎等功效，對(duì)心血管和免疫系統(tǒng)也具有一定的藥理作用。澤瀉也是六味地黃丸等中成藥的主要原料之一，每年的需求量6 000～8 000 t，應(yīng)用廣、出口量大，具有廣闊的市場(chǎng)前景。澤瀉為著名川產(chǎn)地道藥材，主要產(chǎn)于四川、福建和江西，分別稱為川澤瀉、建澤瀉和江澤瀉，川澤瀉目前已占澤瀉市場(chǎng)用量的70%～80%。澤瀉質(zhì)量是市場(chǎng)開發(fā)的關(guān)鍵，其質(zhì)量指標(biāo)主要包括灰分、浸出物、23乙酰澤瀉醇B。萜類成分24乙酰澤瀉醇A和23乙酰澤瀉醇B是澤瀉主要的利尿活性成分，常用于評(píng)價(jià)澤瀉品質(zhì)和相關(guān)藥物生產(chǎn)。《中國(guó)藥典》（2015年版）規(guī)定，澤瀉藥材中醇溶性浸出物的含量不能低于10% [1]，有研究發(fā)現(xiàn)市場(chǎng)上的川澤瀉醇浸出物含量達(dá)標(biāo)準(zhǔn)，但其含量較建澤瀉低6%左右;建澤瀉中23乙酰澤瀉醇B含量較高，而川澤瀉中24乙酰澤瀉醇A含量較高 [2-3]。因此，優(yōu)化和改善川澤瀉的加工工藝是進(jìn)一步提高川澤瀉市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力的重要途徑。

“發(fā)汗”是中藥材產(chǎn)地加工中常用的方法之一。“發(fā)汗”是將鮮藥材加熱或半干燥后，密閉堆積發(fā)熱，使其內(nèi)部含水量向外蒸發(fā)，并凝結(jié)成水珠附于藥材的表面，其目的是加快藥材的干燥，有利于藥材的保存，適用于澤瀉、厚樸、杜仲等藥材。研究表明，“發(fā)汗”加工過(guò)程會(huì)在一定程度上對(duì)藥材的外表性狀、內(nèi)在成分含量、藥用療效等方面有影響 [4]。通過(guò)市場(chǎng)調(diào)研得知，川澤瀉主要藥效成分含量也能夠通過(guò)“發(fā)汗”得以提高，但產(chǎn)地發(fā)汗方法不規(guī)范、工藝參數(shù)還有待通過(guò)試驗(yàn)探究?jī)?yōu)化。該研究以川澤瀉為研究對(duì)象，針對(duì)目前澤瀉生產(chǎn)上發(fā)汗的實(shí)際情況，通過(guò)試驗(yàn)探究影響川澤瀉質(zhì)量的3個(gè)因素即環(huán)境溫度、發(fā)汗時(shí)間和含水量，并利用響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)汗工藝，以期為提高川澤瀉質(zhì)量和功效奠定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試原料。川澤瀉，產(chǎn)地為四川眉山市彭山區(qū)，經(jīng)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)陳興福教授鑒定為澤瀉科植物澤瀉Alisma orientalis（Sam.）Juzep.的干燥塊莖。

1.1.2 主要儀器。安捷倫1120 4286AA高效液相色譜儀，安捷倫公司;101-A3型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海捷呈有限公司;萬(wàn)能高速粉碎機(jī)，廣東旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司;FT10-2高速臺(tái)式離心機(jī)，北京金洋萬(wàn)達(dá)科技有限公司。

1.1.3

主要試劑。24乙酰澤瀉醇A、23乙酰澤瀉醇B標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)買于成都格利普生物科技有限公司;甲醇和乙腈（色譜純），購(gòu)買于南京化學(xué)試劑股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1

灰分含量測(cè)定。參考《中國(guó)藥典》（2015年版）“通則2302灰分測(cè)定法”中第一法測(cè)定 [1]。平行測(cè)定3次，即得。

1.2.2

浸出物含量測(cè)定。參考《中國(guó)藥典》（2015年版）“通則2201浸出物測(cè)定法”中第二法測(cè)定 [1]，平行測(cè)定3次，即得。

1.2.3

23乙酰澤瀉醇B、24乙酰澤瀉醇A的含量測(cè)定。

1.2.3.1

標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備。分別精密稱取適量24乙酰澤瀉醇A和23乙酰澤瀉醇B標(biāo)準(zhǔn)品于15 mL容量瓶中，加入 10 mL乙腈定容，搖勻，得到24乙酰澤瀉醇A母液濃度為 0.02 mg/mL，23乙酰澤瀉醇B母液濃度為0.03 mg/mL。

1.2.3.2

供試品溶液的制備。精密稱取澤瀉粉末0.2～ 0.5 g置離心管中，加入乙腈10 mL，密塞，超聲處理（75 W，45 kHz）20 min，冷卻，在4 000 r/min條件下離心20 min，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

1.2.3.3

樣品測(cè)定。采用高效液相色譜法測(cè)定樣品中的24乙酰澤瀉醇A和23乙酰澤瀉醇B含量。色譜條件：色譜柱為Eclipse Plus C 18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動(dòng)相為乙 腈-水（V∶V=78∶22）;流速0.8 mL/min;柱溫25 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng) 208 nm;進(jìn)樣量10 μm。

1.2.4

浸出物綜合評(píng)分方法。采用標(biāo)準(zhǔn)分轉(zhuǎn)化的方法進(jìn)行試驗(yàn)綜合評(píng)分 [5]。浸出物、23乙酰澤瀉醇B和24乙酰澤瀉醇A為澤瀉的主要質(zhì)量指標(biāo)，因此以這3個(gè)指標(biāo)的綜合評(píng)分作為響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的響應(yīng)值。對(duì)不同條件下發(fā)汗?jié)蔀a的浸出物、23乙酰澤瀉醇B和24乙酰澤瀉醇A含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)分轉(zhuǎn)化，因該試驗(yàn)各指標(biāo)最大值為最優(yōu)，最大值計(jì)為100分，最小值計(jì)0分，根據(jù)藥典各成分含量要求及實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，將浸出物權(quán)重比例設(shè)置為40%，23乙酰澤瀉醇B設(shè)置為50%，24乙酰澤瀉醇A設(shè)置為10%。各試驗(yàn)項(xiàng)的得分（Xi）=100×（Xi-X min）/（X max-X min）。各指標(biāo)結(jié)果按此公式轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)分后，按指標(biāo)權(quán)重比例得到綜合評(píng)分，其計(jì)算公式為： Xi=50%×100×（X 1i-X 1min）/（X 1max-X 1min）+40%×100×（X 2i-X 2min）/（X 2max-X 2min）+10%×100×（X 3i-X 3min）/（X 3max-X 3min），式中，X1為浸出物，X2為23乙酰澤瀉醇B，X3為24乙酰澤瀉醇A。

1.2.5 單因素試驗(yàn)。《中國(guó)藥典》（2015年版）中明確說(shuō)明“發(fā)汗”加工法的操作方法，即直接將一定量的中藥材堆積，進(jìn)行“發(fā)汗”。該研究模擬藥材真實(shí)發(fā)汗環(huán)境，全程用培養(yǎng)箱嚴(yán)格控制溫度條件。

1.2.5.1

環(huán)境溫度對(duì)發(fā)汗效果的影響。澤瀉多于秋末冬初進(jìn)行采收和加工，發(fā)汗常于室外進(jìn)行。在澤瀉樣品含水量為15%、發(fā)汗時(shí)間為72 h條件下，該試驗(yàn)在培養(yǎng)箱嚴(yán)格控制溫度穩(wěn)定的情況下，分別考察發(fā)汗時(shí)環(huán)境溫度為15、25、35、45、55 ℃時(shí)對(duì)澤瀉質(zhì)量綜合評(píng)分的影響。

1.2.5.2

發(fā)汗時(shí)間對(duì)發(fā)汗效果的影響。取干燥澤瀉適量，在環(huán)境溫度為25 ℃、含水量為15%條件下，分別考察發(fā)汗時(shí)間為24、36、72、108、144 h時(shí)對(duì)澤瀉質(zhì)量綜合評(píng)分的影響。

1.2.5.3

含水量對(duì)發(fā)汗效果的影響。取干燥澤瀉適量，當(dāng)澤瀉含水量分別為10%、15%、20%、25%、30%時(shí)，均在25 ℃條件下發(fā)汗72 h，考察不同原料澤瀉的含水量對(duì)澤瀉質(zhì)量綜合評(píng)分的影響。

1.2.6 響應(yīng)面法優(yōu)化澤瀉發(fā)汗工藝。

1.2.6.1

響應(yīng)面法優(yōu)化工藝。根據(jù)單因素考察結(jié)果得到初步優(yōu)化范圍，采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)同一批次澤瀉藥材在培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行發(fā)汗處理，以浸出物、24乙酰澤瀉醇A和23乙酰澤瀉醇B含量的綜合評(píng)分為響應(yīng)值，對(duì)環(huán)境溫度（A）、發(fā)汗時(shí)間（B）、含水量（C）3個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化。對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合分析（Design-Expert 8.0.6軟件），剔除影響不顯著因素后，得到其數(shù)學(xué)模型。利用上述模型和方程分析預(yù)測(cè)最佳發(fā)汗工藝參數(shù)。

1.2.6.2

顯著性檢驗(yàn)。對(duì)回歸方程進(jìn)行方差和顯著性 分析。

1.2.6.3

模型的驗(yàn)證。根據(jù)回歸模型優(yōu)選出的最佳工藝，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)定3次平行試驗(yàn)的綜合評(píng)分，觀察是否與預(yù)測(cè)值吻合，從而表明該試驗(yàn)所建立的數(shù)學(xué)模型的可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 灰分和浸出物的含量測(cè)定

試驗(yàn)測(cè)得供試品中灰分含量均小于5%，浸出物含量均大于10%，符合藥典規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 23乙酰澤瀉醇B、24乙酰澤瀉醇A的含量測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)品和供試樣品的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，供試品中含有測(cè)定目標(biāo)成分，即在保留時(shí)間8 min左右出現(xiàn)24乙酰澤瀉醇A的峰，18 min左右出現(xiàn)23乙酰澤瀉醇B的峰，因此測(cè)定數(shù)據(jù)可用于進(jìn)一步分析。

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1

環(huán)境溫度對(duì)發(fā)汗效果的影響。由圖2a可知，隨環(huán)境溫度的增加，綜合評(píng)分呈先上升后略下降的趨勢(shì)，環(huán)境溫度為45 ℃時(shí)，綜合評(píng)分達(dá)到最高值。這可能是環(huán)境溫度的升高能夠增強(qiáng)澤瀉內(nèi)源酶活性，從而促進(jìn)相關(guān)的生化反應(yīng)，當(dāng)溫度達(dá)到一定值后，可能會(huì)由于熱脅迫而刺激澤瀉的發(fā)汗產(chǎn)物進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成次級(jí)代謝產(chǎn)物，如萜類等，從而對(duì)質(zhì)量綜合評(píng)分產(chǎn)生影響 [6]。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)15 ℃條件下澤瀉無(wú)發(fā)汗表現(xiàn)，55 ℃條件下發(fā)汗?jié)蔀a表現(xiàn)出發(fā)霉嚴(yán)重的情況，因此選取25、35、45 ℃為后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)的3個(gè)水平。

2.3.2

發(fā)汗時(shí)間對(duì)發(fā)汗效果的影響。由圖2b可知，隨發(fā)汗時(shí)間增長(zhǎng)，綜合評(píng)分呈先上升后略下降的趨勢(shì)。這可能是隨發(fā)汗時(shí)間延長(zhǎng)，發(fā)汗過(guò)程中的生理生化反應(yīng)進(jìn)行得更徹底，從而提高了藥材質(zhì)量。試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)汗時(shí)間為108 h時(shí)澤瀉出現(xiàn)輕微發(fā)霉現(xiàn)象，至144 h時(shí)發(fā)汗?jié)蔀a發(fā)霉嚴(yán)重，因此選擇36、72、108 h為后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)的3個(gè)水平。

2.3.3

含水量對(duì)發(fā)汗效果的影響。由圖2c可知，隨含水量的增加，綜合評(píng)分呈先上升后下降的趨勢(shì)。這可能是含水量對(duì)澤瀉內(nèi)部酶活性有一定影響。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)10%含水量條件下發(fā)汗?jié)蔀a無(wú)明顯發(fā)汗表現(xiàn)，30%含水量條件下發(fā)汗?jié)蔀a出現(xiàn)較嚴(yán)重發(fā)霉情況，因此選擇10%、15%、20%為后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)的3個(gè)水平。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化澤瀉發(fā)汗工藝

2.4.1 回歸分析。經(jīng)回歸分析得到響應(yīng)面數(shù)學(xué)模型：

Y= 54.55-8.13A+3.18B-0.64C+4.36AB-22.15AC-7.00BC- 1.70A2-22.60B2-7.21C2。由表1綜合評(píng)分結(jié)果分析，最佳發(fā)汗工藝參數(shù)為環(huán)境溫度25 ℃、發(fā)汗時(shí)間72 h、含水量20%，此條件下綜合評(píng)分為86.31。結(jié)合上述回歸模型分析預(yù)測(cè)，最佳發(fā)汗工藝參數(shù)為環(huán)境溫度45 ℃、發(fā)汗時(shí)間94 h、含水量10%，此條件下綜合評(píng)分為93.10。

由圖3中的三維響應(yīng)曲面圖可得，發(fā)汗時(shí)間和含水量對(duì)整個(gè)發(fā)汗工藝影響顯著，環(huán)境溫度對(duì)整個(gè)工藝影響不顯著，環(huán)境溫度和含水量交互作用顯著。

2.4.2

顯著性檢驗(yàn)。對(duì)回歸方程進(jìn)行方差和顯著性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型的F=7.60、P=0.007 0，說(shuō)明選用的模型具有顯著性。發(fā)汗時(shí)間和含水量的二次項(xiàng)的P<0.05，說(shuō)明發(fā)汗時(shí)間和含水量對(duì)整個(gè)發(fā)汗工藝影響顯著;環(huán)境溫度及其二次項(xiàng)的P>0.05，因此環(huán)境溫度對(duì)整個(gè)工藝影響不顯著。環(huán)境溫度和含水量交互項(xiàng)的P<0.05，表明溫度和含水量交互作用顯著，其他因素間的交互作用不顯著。這與圖3顯示的結(jié)果基本一致。

2.4.3

模型的驗(yàn)證。根據(jù)回歸模型優(yōu)選出的最佳工藝，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，3次平行試驗(yàn)的綜合評(píng)分為94.02± 0.02，此時(shí)發(fā)汗?jié)蔀a浸出物含量為（15.34±0.02）%，23乙酰澤瀉醇B含量為（0.06±0.02）mg/mL，24乙酰澤瀉醇A含量為 （0.02±0.01）mg/mL，與預(yù)測(cè)值吻合，表明該試驗(yàn)所建立的數(shù)學(xué)模型準(zhǔn)確可靠，優(yōu)化出的一體化最佳工藝重現(xiàn)性好，表明該最佳工藝切實(shí)可行、可操作性強(qiáng)。

3 結(jié)論與討論

發(fā)汗時(shí)間、環(huán)境溫度和含水量的交互效應(yīng)對(duì)澤瀉發(fā)汗工藝效率影響均較為顯著。該試驗(yàn)以環(huán)境溫度、發(fā)汗時(shí)間和含水量為考察因素，以浸出物、23乙酰澤瀉醇B和24乙酰澤瀉醇A含量加權(quán)所得到的綜合評(píng)分為指標(biāo)，通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)建立澤瀉發(fā)汗加工的最佳工藝為環(huán)境溫度45 ℃、發(fā)汗時(shí)間94 h、含水量10%。得到的最佳工藝數(shù)據(jù)對(duì)澤瀉產(chǎn)地加工中的發(fā)汗過(guò)程有重要指導(dǎo)意義，以此可規(guī)范澤瀉發(fā)汗加工方法，也可為建造產(chǎn)地發(fā)汗加工設(shè)施與加工設(shè)備提供參考，以提高澤瀉加工的產(chǎn)業(yè)化水平。

該試驗(yàn)研究了影響發(fā)汗效果的主要關(guān)鍵因素。發(fā)汗過(guò)程受到溫度、水分、時(shí)間、堆積量等條件因素的影響 [7]，該研究選擇了溫度、水分和時(shí)間3個(gè)因素進(jìn)行探究，主要基于堆積量通過(guò)溫度、水分影響發(fā)汗效果，根據(jù)具體條件在有效控制溫度、水分情況下，選擇適宜的規(guī)程量。于凡等 [8]在探究不同發(fā)汗條件對(duì)丹參品質(zhì)影響的研究中采用了溫度和水分2個(gè)相同探究因素，也得到顯著結(jié)果，說(shuō)明通過(guò)改變發(fā)汗條件提高中藥材品質(zhì)的方法具有普遍可行性。其他中藥材如杜仲等，產(chǎn)地加工中進(jìn)行發(fā)汗處理，也得到與該試驗(yàn)研究相同的效果。

“發(fā)汗”是提高藥材產(chǎn)地加工質(zhì)量的一種有效方法，藥材發(fā)汗加工后多有外觀性狀和化學(xué)成分的變化 [3]。近年來(lái)關(guān)于“發(fā)汗”對(duì)藥材影響方面的文獻(xiàn)主要涉及化學(xué)成分和藥理作用2個(gè)方面 [9]，如厚樸經(jīng)發(fā)汗加工過(guò)程后，厚樸酚總量比未發(fā)汗前增加了7.94% [10]，續(xù)斷發(fā)汗后用于治療白血病的活性物質(zhì)川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量也有一定提升 [11]。該試驗(yàn)研究也證實(shí)了通過(guò)發(fā)汗能夠提高澤瀉質(zhì)量。目前研究者們對(duì)發(fā)汗加工的研究方向多集中在觀察加工過(guò)程前后中藥材活性有效成分的含量變化，且多數(shù)研究也表明發(fā)汗過(guò)程對(duì)藥材化學(xué)成分含量有一定的影響，為以后對(duì)發(fā)汗更深入的研究提供了較好的試驗(yàn)基礎(chǔ)，未來(lái)對(duì)發(fā)汗的研究應(yīng)轉(zhuǎn)向?qū)ζ溥^(guò)程中內(nèi)在作用機(jī)制的探究，從而為發(fā)汗加工法在市場(chǎng)中推廣和產(chǎn)地應(yīng)用提供可靠的理論依據(jù) [12]。