BET抑制劑(+)-JQ1通過調節NF-KB信號通路保護小鼠急性肝衰竭實驗研究*

黃鶴鳴，劉彥君，付 榮，石催催，范建高，張元元，羅 成，李光明

急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)發病率較低，常伴隨有大量的肝細胞壞死，是一種嚴重的臨床綜合征。ALF常發生在沒有基礎肝臟疾病的人群，預后極差[1-3]。有研究表明，在ALF的發病機制中，巨噬細胞來源的促炎癥細胞因子大量釋放會導致肝細胞損傷壞死。因此，抑制過度激活的炎癥反應可能會對肝損傷具有一定的保護作用[4，5]。(+)-JQ1是一種溴結構域和額外末端結構域(bromo-and extra-terminal domain，BET)抑制劑，近期發現其具有很強的抗炎作用。基于ALF發病過程中存在過度炎癥反應激活導致的肝細胞損傷，推測(+)-JQ1可能對ALF具有一定的保護作用。本研究旨在探討(+)-JQ1對脂多糖/D氨基半乳糖(LPS/D-Gal)誘導的ALF小鼠的保護作用及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物、藥物與主要試劑 雄性C57BL/6小鼠，10～12周齡，體質量約為24～26 g，SPF級，購自中國科學院上海藥物研究所。LPS和D-Gal購自美國Sigma公司。RNA抽提試劑盒、反轉錄試劑盒和RT-qPCR試劑盒均購自南京諾維贊生物科技有限公司。抗P-IKB、抗IKB、抗P65、抗P-P65和抗GAPDH抗體均購自美國Cell Signaling Technology, Inc(CST)公司。BCA蛋白定量試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司，(+)-JQ1由中國科學院上海藥物所提供。

1.2 ALF小鼠模型的制備 所有動物實驗均符合中國科學院上海藥物研究所動物倫理委員會的相關規定。將小鼠飼養在標準實驗室(21±2℃，12 h明暗交替光照)，自由飲食飲水，飼養1 w后開始動物實驗。將47只小鼠隨機分為對照組15只、ALF模型組17只和(+)-JQ1干預組15只。在ALF模型組和(+)-JQ1干預組，給予動物LPS 2 mg.kg-1和D-Gal 250 mg.kg-1混合溶液(LPS:D-GAL=1:125)0.3 ml腹腔注射。在LPS/D-Gal處理前2 h，在(+)-JQ1干預組給予動物(+)-JQ1 50 mg.kg-10.3 ml腹腔注射，在ALF模型組和對照組給予同等體積的0.9%生理鹽水腹腔注射。在LPS/D-Gal刺激4 h后，每組各處死5只小鼠，取血取肝。獲得的全血經3000 r/m 4℃離心15 min，取上清，置于-80℃保存。將一部分肝組織浸泡在4%多聚甲醛溶液固定24 h，脫水、石蠟包埋，切片，HE染色；另一部分保存在-80℃冰箱。將其余小鼠繼續喂養至72 h，觀察存活率。

1.3 血清檢測 使用Chemray240全自動生化分析儀檢測血生化指標；采用ELISA法檢測TNF-α(美國Thermo公司)。

1.4 肝組織促炎細胞因子mRNA檢測 取適當肝組織，研磨后用RNA抽提試劑盒抽提RNA，用Hiscript q-RT SuperMix for q-PCR 反轉錄試劑盒逆轉錄，用ChamQ SYBR Qpcr Master Mix 試劑盒(RT-qPCR法)檢測肝組織TNF-α、IL-6和IL-1B mRNA水平。以GAPDH作為內參照，所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。IL-6正義鏈：5’-AGTTGCCTTCTTGGGACTGA，反義鏈：TCCACGATTTCCCAGAGAAC-3’；TNF-α 正義鏈：5’-CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA-3’，反義鏈：5’-TGGGAGTAGACAAGGTACAACCC-3’；IL-1B正義鏈：5’-TCTTTGAAGTTGACGGACCC-3’，反義鏈：5’-TGAGTGATACTGCCTGCCTG-3’；GAPDH正義鏈：5’-GGTGAAGGTCGGTGTGAACGGA-3’，反義鏈：5’-CCAAAGTTGTCATGGATGACCTTGG-3’。

1.5 肝組織相關蛋白表達檢測 采用Western blotting 法，取適量肝組織，置于裝有200 l RIPA溶液的EP管中，使用組織研磨儀研磨，將獲得的均質溶液以最高速離心，取上清，采用BCA法定量檢測蛋白濃度，用RIPA溶液調整蛋白濃度。在110 v電泳90 min。，在300 mA條件下50 min分離凝膠，轉至NC膜上。用5%牛奶封閉1 h，以GAPDH(CST，97166)為內參，分別加抗 P65(CST,8242)、抗P-P65(CST,3033)、抗IKB(CST,4814)和抗P-IKB(CST,2859)抗體，4℃孵育過夜。次日，加二抗孵育1 h，采用化學發光法顯影，觀察蛋白表達量。

2 結果

2.1 各組小鼠存活率比較 模型組72 h存活率為16.7%，(+)-JQ1干預組為60.0%，兩組無統計學差異(P>0.05)；對照組小鼠全部存活。

2.2 各組小鼠肝組織病理學表現 在LPS/D-Gal刺激4 h后，小鼠肝臟充血明顯，呈暗紅色，肝臟明顯增大；在(+)-JQ1干預后小鼠肝臟充血明顯得到改善，肝臟顏色呈淡粉色，且肝臟大小相對于對照組未見明顯變化(圖1)。ALF模型組動物肝組織結構嚴重破壞，充血明顯，大量肝細胞壞死，伴有大量的炎細胞浸潤；在(+)-JQ1干預后，肝細胞壞死和炎細胞浸潤明顯改善，肝臟內未見充血，肝組織結構基本正常(圖2)。

圖1 各組小鼠肝臟大體觀

圖2 各組小鼠肝組織病理學表現(HE,100×)

2.3 各組小鼠血清ALT和AST水平比較 ALF模型組血清ALT和AST顯著高于對照組，而(+)-JQ1干預組血清ALT和AST水平顯著低于模型組，差異具有統計學意義(P<0.05，表1)。

表1 各組小鼠血清ALT和AST水平比較

2.4 各組小鼠血清TNF-α和肝組織細胞因子mRNA水平比較 對照組、ALF組和(+)-JQ1干預組小鼠血清TNF-α水平分別為(2.5±0.5)pg/ml、(631.6±57.5)pg/ml和(139.8±8.1)pg/ml，差異顯著(P<0.05)。ALF組小鼠肝組織TNF-α、IL-6和IL-1B mRNA水平較對照組顯著增高(P<0.05)，而經(+)-JQ1干預后則顯著降低(P<0.05，表2)。

表2 各組小鼠肝組織細胞因子mRNA水平比較

2.5 各組小鼠肝組織NF-KB信號通路相關蛋白表達量比較 與對照組比，模型組肝組織P-IKB和P-P65蛋白表達量顯著增強(P<0.05)，而(+)-JQ1干預后P-IKB和P-P65蛋白表達量顯著減弱(P<0.05)，ALF模型組IKB蛋白表達量較對照組顯著減弱(P<0.05)，而(+)-JQ1干預組減弱不顯著(圖3)。

圖3 各組小鼠肝組織NF-KB信號通路相關蛋白表達量ALF模型小鼠肝組織 P-P65和P-IKB蛋白表達增強

3 討論

ALF是一種少見但病死率很高的臨床疾病，可由多種因素導致。由于肝衰竭導致腦、腎、肺和心等功能衰竭，病情兇險。不論哪種病因均伴有肝內炎癥細胞浸潤，體內炎癥反應過強或過弱均會給機體帶來不良的影響[6-8]。ALF時過度激活的炎癥反應可導致肝細胞壞死，加重肝臟損傷。當肝臟內細胞壞死和細胞再生無法達到平衡時則會發生ALF[9]。因此，精密調節炎癥反應對疾病的控制至關重要[10-13]。有研究表明，BET蛋白在巨噬細胞釋放促炎細胞因子過程中起到關鍵性作用，而其抑制劑(+)-JQ1可以有效地抑制過度激活的炎癥反應[14-16]。經腹腔聯合注射LPS/D-Gal誘導小鼠ALF是經典的ALF模型。LPS是革蘭氏陰性菌的主要成分，它主要通過作用于肝臟枯否細胞來誘導肝損傷。LPS可刺激枯否細胞大量釋放多種促炎細胞因子，包括TNF-α、IL-6和IL-1B，誘導ALF小鼠肝細胞壞死和凋亡。血清ALT和AST是肝臟損傷的重要標志。ALF患者血清ALT和AST會明顯升高。在本實驗中我們觀察到ALF小鼠血清ALT和AST水平明顯升高，而且促炎細胞因子TNF-α、IL-6和IL-1B水平也明顯升高，肝臟組織學表現為肝臟組織明顯受損，證實ALF小鼠模型制備成功。此外，(+)-JQ1可以有效地抑制LPS/D-Gal聯合誘導導致的過度激活的炎癥反應，抑制促炎細胞因子TNF-α、IL-6和IL-1B分泌，降低血清ALT和AST水平，具有很好的肝臟保護作用。

炎癥反應受多條信號通路的調控，NF-KB信號通路則是其中之一。LPS是NF-KB強有力的激活劑，NF-KB信號通路激活可導致一系列炎癥反應相關基因表達增加，NF-KB是多種炎癥反應的中心環節[17, 18]。當沒有外界刺激時，NF-KB主要位于胞漿，以P65和P50組成的二聚體與IKB結合。當細胞受到刺激后，IKB蛋白發生磷酸化而降解，從而暴露出NF-KB，此時NF-KB二聚體由胞漿轉入到細胞核，參與多種基因轉錄的表達，其中主要包括調控促炎細胞因子表達的基因。在ALF小鼠模型，NF-KB的激活會促使細胞凋亡信號通路的激活并且促進大量促炎細胞因子的釋放，在肝細胞凋亡及肝損傷中發揮重要作用，與ALF的預后密切相關。本實驗結果表明ALF模型組IKB蛋白表達明顯減少，而P-P65和P-IKB蛋白表達顯著增多。在(+)-JQ1干預后可明顯下調P-P65和P-IKB蛋白的表達，在一定程度上恢復IKB蛋白的表達量。因此，考慮(+)-JQ1可能通過調節NF-KB信號通路來抑制促炎細胞因子的表達，抑制肝細胞的壞死，從而減輕肝組織結構和肝功能的損傷。目前，ALF尚無有效的治療方法，(+)-JQ1在防治ALF中可能具有一定的臨床應用價值，值得進一步探討。