白藜蘆醇對部分肝切除術大鼠肝再生和肝組織NK細胞活性的影響*

李 偉，郭春霞，劉蘇南

我國肝癌患病率較高，每年因患肝癌死亡的人數超過10萬人[1,2]。目前，主要的治療肝癌方法為手術切除腫瘤，但大多數患者在就診時已是中晚期，且合并有肝硬化、剩余健康肝組織較少，影響了手術的進行。在正常情況下，肝臟細胞的增殖指數很低。當肝臟組織遭遇損傷，如肝臟切除時，肝臟則表現出強大的再生能力。肝臟再生能力的強弱對于患者的預后具有重要的意義[3]。因此，肝臟再生的機制和如何促進肝臟大部分切除后迅速再生是目前研究的熱點。白藜蘆醇(resveratrol，RES)是非黃酮類的多酚化合物，具有抗衰老、抗癌、抗炎、抗氧化等作用[4]。同時，RES對肝再生(liver regeneration, LR)也有一定的影響[5]。但目前關于RES對LR和肝臟自然殺傷(natural killer，NK)細胞的影響研究，觀點尚不完全統一。本文旨在研究RES對肝部分切除大鼠術后LR和肝組織NK細胞活性變化的影響，以期了解RES對肝臟保護作用的機理，從而為肝臟疾病的臨床治療提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物、藥物、試劑與儀器 90只SPF級SD大鼠購自廣東醫學院實驗動物中心(粵監證字 2018A029號)，在本院實驗室飼養，飼養溫度為22～25℃，濕度50%～60%，明暗交替12 h，本實驗經過我院動物倫理委員會批準同意，且本動物實驗嚴格遵循動物實驗減少(reduction)、優化(refinement)和替代(replacement)，即3R原則。白藜蘆醇(純度>98%)購自上海生工生物有限公司；抗增殖細胞核抗原(PCNA)單克隆抗體購自武漢博士德生物公司；抗CyclinDl抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG和總蛋白提取試劑盒購自上海貝博生物；抗FcγRⅡ/Ⅲ抗體和小鼠抗大鼠CD3抗體購自美國Catltag公司；蒸汽滅菌鍋購自上海醫用儀器廠；動物電子稱重儀(型號：BK 8801B)購自武漢華聯科有限公司；WB試劑盒購自南京建成生物工程研究所；電子天平(型號：BS-124s)購自北京賽多斯儀器系統有限公司；正置型金相顯微鏡(型號：SG-51)購自上海光學儀器廠；低溫離心機(型號：TGL-16M)購自濟南來寶醫療器械有限公司；轉膜儀和蛋白電泳購自美國Bio-Rad公司；凝膠成像系統購于以色列DNR公司；實驗室切片(型號：LD-66)機購自長沙益廣制藥機械公司；XH-600γ計數儀購自西安市國營二六二廠；流式細胞儀(型號：Attune NxT)購自賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 動物分組與藥物干預 將90只大鼠適應性喂養1 w，參考Gershbein et al[6]報道的方法，制備大鼠肝臟切除模型。采用隨機數字表法將動物分為對照組、小劑量白藜蘆醇和大劑量白藜蘆醇處理組，每組30只。在術前5 d，在小、大劑量白藜蘆醇處理組大鼠，分別給予白藜蘆醇10 g.kg-1·d-1和20 g.kg-1·d-1尾靜脈注射，在對照組，經尾靜脈注射等量的生理鹽水。術前禁食12 h，不禁飲，給予5%水合氯醛0.5 ml/100 g經尾靜脈注射麻醉，將大鼠以仰臥位固定于自制手術臺上，在切口周圍備皮，并以安爾碘消毒，取上腹正中切口，于劍突下切開皮膚、肌肉和腹膜，切口長約2.0～4.0 cm，拉開并暴露腹腔，在腰背部墊一腰橋，暴露肝臟和肝門，用無菌棉簽于肝十二指腸韌帶前筋膜分離門靜脈，行70%大鼠肝葉切除術，術中用6-0絲線在遠離肝葉血管蒂根部依次縫扎肝左外葉、肝中葉、肝尾狀葉和肝蒂，術畢消毒。

1.3 肝再生指數檢測[7]在術后24 h和48 h，經乙醚麻醉后采用針刺心臟放血法每組分別處死15只大鼠，擦拭肝臟表面的血跡后檢測肝臟質量，使用電子稱測量大鼠肝臟濕質量，在門靜脈結扎組大鼠分別要減去結扎肝葉的肝質量，并計算肝臟再生指數。肝再生指數=肝臟濕質量/體質量×100%。

1.4 大鼠肝組織NK細胞百分率檢測[8]取大鼠肝臟，切碎后使用濾網過濾，收集細胞懸液，使用pH為7.6、濃度為0.83%NH4CI-Tris緩沖液溶血。將溶解的細胞懸液加入離心管，1000 g離心2 min，棄上清液，加入抗FcγRⅡ/Ⅲ抗體10 μL，在4℃條件下培育10 min，再加入抗大鼠IgG抗體和抗CD3抗體10 μL，加入碘化丙啶5 μL，使用流式細胞儀檢測大鼠NK細胞數量，計算NK細胞百分比。

1.5 大鼠肝臟NK細胞殺傷活性檢測 采用51Cr釋放法檢測，取對數生長期的YAC-1細胞，加入2.22×106BqMCr，用RPMI-1640補充體積到200 μL，37℃條件下孵育120 min，用RPMI-1640洗滌3次，配制成1×105/ml的細胞懸液。NK和YAC-l細胞混合比例為50：1，4 h后取上清液100 μL，使用XH-600γ計數儀測定放射性活性(cpm)，計算NK細胞特異性殺率。

1.6 肝組織蛋白表達檢測[9]采用Western blot法，檢測大鼠肝組織PCNA和CyclinD1蛋白的相對表達量。取大鼠肝臟組織消化后，提取總蛋白，轉移到PVDF膜，室溫封閉2 h后加入各需要檢測蛋白的一抗和二抗，孵育2 h，以β-actin為內參蛋白，檢測蛋白灰度值/β-actin灰度值為目標蛋白的相對表達水平。

1.7 統計學方法 應用SigmaStat 3.5軟件，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD法，檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 各組大鼠肝臟再生指數比較 在實驗24 h和48 h，白藜蘆醇處理組大鼠肝臟再生指數顯著升高(P<0.05)，且隨著劑量增加而升高(P<0.05，表1)。

表1 各組大鼠肝臟再生指數比較

2.2 各組大鼠肝臟NK細胞百分率和NK細胞活性比較 在實驗24 h和48 h，白藜蘆醇處理組大鼠肝臟NK細胞百分率和NK細胞活性顯著升高(P<0.05)，且隨著劑量增加而升高(P<0.05，表2)。

表2 各組大鼠肝臟NK細胞百分率和細胞活性比較

2.3 各組大鼠肝組織PCNA和CyclinD1蛋白表達比較 在實驗24 h和48 h，白藜蘆醇處理組大鼠肝組織PCNA和CyclinD1蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)，且隨著劑量增加而升高(P<0.05，圖1)。

圖1 各組大鼠肝組織PCNA和CyclinD1蛋白表達

3 討論

肝臟受到損傷或者肝臟在遇到外界干擾和刺激后，微環境會發生改變，使得其對受損細胞的清除和對損傷較輕細胞的修復能力發生了改變，最終使得其再生能力強于一般組織，被稱之為LR[10]。雖然肝臟具有LR功能，但如何促進其再生成為研究的難點。在肝葉切除圍手術期的肝再生、肝臟保護、移植肝組織的活性等問題卻仍在一定程度上限制了該領域手術的開展。RES處理后對肝臟具有消炎的作用，可以減輕肝竇微血管的淤血和水腫，使得肝竇的修復能力增強，同時可以改善肝細胞術后微循環灌注障礙[11,12]。本研究發現，在實驗24 h和48 h，與對照組比，小劑量白藜蘆醇處理組大鼠肝臟再生指數顯著升高(P<0.05)，且48 h時大鼠肝臟再生指數高于24 h時，說明使用RES處理后大鼠肝臟再生能力顯著提高。有研究表明，RES可以促進肝細胞的再生能力[13]，本研究得出的結論與其相一致。

肝臟含有豐富的免疫功能細胞，具有獨特的免疫系統，也是機體最大的免疫功能器官[14]。當肝臟受損后會直接影響到免疫功能，同時嚴重影響到免疫相關細胞的活性和數量[15]。目前，常見的免疫細胞包括T細胞、B細胞和第三類淋巴細胞，即NK細胞[16]。NK細胞不僅可以作為殺死腫瘤細胞的免疫細胞，同時可以通過釋放細胞因子，發揮免疫調節功能[17]。本研究通過檢測大鼠肝組織NK細胞百分率及其活性，發現小劑量白藜蘆醇處理組大鼠NK細胞百分率和NK細胞殺傷活力均顯著升高，說明使用RES后，大鼠免疫功能得到了顯著的改善，不僅可以減輕肝臟的炎性反應，同時還可以改善免疫功能，促進肝臟恢復。

Cyclin D1是特異性周期蛋白-D1，是高度保守的細胞周期家族[18]。該家族在整個細胞周期中蛋白豐度具有周期性變化，同時該蛋白也是肝細胞進入細胞增殖周期的主要標志物，Cyclin D1的表達和活化是增殖階段一個重要的調控位點[19,20]。PCNA是真核細胞DNA合成所需的一種DNA多聚合酶δ的輔助蛋白，它與細胞周期密切相關，直接參與細胞增殖過程中DNA的復制，其含量和表達程度變化與DNA合成情況一致，反映了細胞的增殖活性[21，22]。本研究發現，使用RES大鼠肝組織PCNA和CyclinD1蛋白表達水平均顯著升高，可能是因為RES具有活血化瘀的作用，減輕了肝組織肝竇微血管的淤血和水腫，改善了肝臟血流動力學，促進了肝臟血流循環，使得肝臟在術后得到了快速的恢復。

綜上所述，RES可以促進大鼠肝部分切除術后肝組織NK細胞活性，促進肝臟再生，其作用機制可能與RES可以減輕肝竇微血管淤血和水腫，使得肝竇的修復能力增強，改善了術后微循環灌注障礙，增強了大鼠肝組織NK細胞的活力有關。本研究也存在一定的不足之處，比如在肝臟受損后，肝臟細胞及其微環境是如何啟動再生機制、早期肝細胞增殖，DNA復制的關鍵基因及其相關信號因子通路是什么，本研究尚未討論，在后續的研究中將根據此思路進一步深入探究這些問題。