急性戊型肝炎血清抗-HEV IgM、IgG和HEV RNA動態變化及其診斷價值

曾慶環，孫亞男，李 鵬，劉遠志，吳燕京，熊 峰，武永樂，曾阿娟，張世斌

目前，急性戊型肝炎(acute hepatitis E，AHE)現癥感染診斷指標包括:①血清和(或)糞便檢測到戊型肝炎病毒(hepatitis E virus，HEV)顆粒或HEV RNA；②抗-HEV IgM陽性；③血清抗-HEV IgG陽轉或滴度有4倍及以上升高[1,2]。一般來說，這三項中任何一項陽性均可作為診斷AHE的依據，若同時有2項陽性則可確診。病毒顆粒或RNA是感染的直接證據，但AHE潛伏期長，病毒血癥短暫，30%～50%患者在發病時體內HEV已基本被清除，其臨床診斷意義有限。抗 HEV IgG陽轉或滴度有4倍及以上升高，這一指標需定期檢測雙份血清，不利于早期診斷，多數患者就診時IgG抗體常已陽轉并達到較高的水平，因此該指標用于診斷急性戊型肝炎的實用性較差。由于在細胞培養中不能大量收獲HEV以制備抗原，從20世紀90年代初期至今，抗HEV特異性IgM和IgG抗體的檢測仍然是通過分子生物學方法合成HEV重組蛋白或合成肽作為抗原，在20多年的臨床應用中發現一些AHE患者抗-HEV IgM和抗-HEV IgG陽性規律、試劑的敏感性和可重復性不如其它自限性病毒，如甲型肝炎病毒等感染，其抗-HEV IgM和抗-HEV IgG血清學分布呈現多樣性，給臨床診斷帶來了困難。我們檢測了我院連續收集的217例AHE患者血清，分析歸納了抗-HEV IgM、抗HEV-IgG和HEV RNA的分布模式和動態變化規律，希望能為臨床診斷提供幫助。

1 資料與方法

1.1 病例來源 2016年1月～2018年3月于我院診治的AHE患者217例，男性122例，女性95例；平均年齡為48.63±16.28歲。納入滿足以下三項條件之一者：1)臨床表現為急性肝炎全身和胃腸道癥狀，或有黃疸，無慢性肝炎病史；2)血生化檢查顯示ALT升高大于正常值上限2.5倍(正常上限為35 U/L)；3)血清學檢測顯示抗-HAV IgM、IgG均陰性，或抗-HAV IgM陰性而抗-HAV IgG 陽性，血清HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc均陰性和HBV DNA陰性，或抗-HBs陽性，或抗-HBs和抗-HBc兩項陽性，或抗-HBs、抗-HBe 和抗-HBc三項陽性，抗-HCV 陰性和HCV RNA陰性，抗EBV-IgM、EBV DNA 均陰性，抗CMV IgM、CMV DNA均陰性，抗-HEV IgM、抗-HEV IgG或 HEV RNA至少有一項陽性者。排除其他病毒性、酒精性、自身免疫性、代謝性肝病和藥物性肝損傷等。

1.2 試劑與儀器 HEV RNA提取和FQ-PCR法檢測試劑盒由北京金豪制藥股份有限公司提供。ELISA法檢測血清抗HEV IgM和抗HEV IgG診斷試劑由北京萬泰生物藥業有限公司提供(分別應用基因重組HEV ORF2抗原和基因重組HEV ORF2/ORF3抗原)。熒光定量PCR分析儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3 血清處理 3500×g離心10 min分離血清，置于-80℃冰箱凍存，避免反復凍融。核酸提取：在1.5 ml離心管中先后加入助沉劑5μl和裂解液200 μl，加入血清100 μl(設陰性對照、臨界陽性對照和強陽性對照)，劇烈震蕩2 min，室溫靜置10 min。加入無水乙醇240 μl，顛倒混勻，將裂解混合物加入吸附柱，3500×g離心2 min，取下套管，倒掉套管中的液體，將吸附柱重新裝入套管，6000×g離心1 min，倒掉套管中的液體，將吸附柱再次重新裝入套管。加入洗液A 500μ l6000×g離心l min，將吸附柱換一個新套管。加入洗液B 500 μl，靜置l min，6000×g離心l min，倒掉套管中的液體，將吸附柱重新裝入套管。加入洗液B 500 μl，6000×g離心1 min，將吸附柱換一根新套管，15521×g離心3 min。將吸附柱裝入無核酸酶1.5 ml離心管，小心在吸附膜中央加入預熱洗脫液50 μl，室溫靜置4 min，9184×g 離心2 min，離心管中液體即為待檢純化的RNA。

1.4 血清HEV RNA檢測 采用熒光RT-PCR法檢測，在1.5 ml離心管中先后加入20 I×l HEV反應液，0.6×Taq 聚合酶，AMV酶0.2μl，震蕩混勻，離心使液體聚至管底，以20μl/管分裝至熒光RT-PCR擴增管。在熒光RT-PCR擴增管中分別加入待檢純化RNA 10 μl，2000×g離心20 s，使液體聚至管底。將擴增管放入熒光RT-PCR擴增儀中，進行擴增反應。逆轉錄及變性:50℃ 30 min，95℃ 3 min；預擴增: 95℃ 15 s，50℃ 30 s，72℃ 1 min，共5個循環。擴增及熒光收集:95℃ 10 s，55℃ 40 s，共40個循環，在55℃收集FAM熒光信號。每次實驗設置強陽性對照、臨界陽性對照和陰性對照。

2 結果

2.1 血清病毒標記物或核酸陽性情況 見表1。

表1 217例AHE患者第一次檢測HEV分布(%)

2.2 75例血清抗-HEV IgM、IgG和HEV RNA二次檢測的變化 在217例患者中，我們對其中75例患者血清抗-HEV IgM、IgG和HEV RNA進行了為期15～76天(中位35天)隨訪。在首次檢測后第3～4周再次行血清檢測。在75例患者中，有1例血清抗-HEV IgM、IgG和HEV RNA均陽性，24例抗-HEV IgM和抗HEV-IgG陽性，27例單項抗-HEV IgG陽性，1例單項抗-HEV IgM陽性和1例抗-HEV IgG和HEV RNA均陽性，在第3～4周復查時，保持血清標記物或核酸陽性不變；21例在隨訪過程中出現抗-HEV IgM和HEV RNA陰轉和/或抗-HEV IgG陽轉；有3例血清抗-HEV IgM、IgG均陽性患者分別在第29天、36天和40天出現抗-HEV IgM消失，其余患者血清學分布模式保持不變(表2)。

表2 75例AHE患者血清抗-HEV IgM、IgG和HEV RNA陽(%)性變化

2.3 部分病例血清抗-HEV IgM、IgG和HEV RNA動態變化 在138例有明確的發病日期患者，血清抗-HEV IgM、IgG和HEV RNA陽性均最早出現在第2個病日。AHE患者血清 HEV RNA存在時間短，在第一病周陽性率最高；血清抗-HEV IgM陽性檢出率于第一病周最高，隨時間延長檢出率逐漸下降；血清抗-HEV IgG陽性檢出率在不同病周均高于HEV RNA和抗-HEV IgM，且隨著時間延長其陽性檢出率不斷升高，第四病周和病程超過4周以后血清抗-HEV IgG陽性檢出率達100.0%(表3)。

表3 不同病周血清抗-HEV IgM、IgG和HEV RNA陽性率(%)變化

3 討論

AHE是一種經消化道傳播的急性病毒性肝炎，常見于發展中國家，在亞洲、非洲和我國新疆地區均有因水源污染而引起大規模暴發流行的報道。人群感染HEV后病死率為1%～2%，但在懷孕的婦女，病死率卻高達20%～25%[3-6]。AHE患者血清抗-HEV IgG和IgM陽性具有多樣性[7-10]，抗-HEV IgG可同時出現于戊型肝炎的急性期和恢復期，抗-HEV IgM的反應強度低于甲型肝炎，持續時間也較短，可在戊型肝炎急性期早期便已消失，甚至在發病時已檢測不到該指標，出現這種現象的原因仍不清楚，可能與戊型肝炎本身潛伏期較長，部分患者發病時抗-HEV IgG滴度已經升高到較高的水平[11-14]。目前，國內報道采用ELISA診斷試劑檢測的靈敏度為45%～94%，特異性為73%～100%[15-17]。

本研究中，217例患者發病初期血清抗-HEV IgM、IgG、HEV RNA陽性變化有一定的規律。按照急性自限性病毒現癥感染的血清學診斷依據，了解血清學陽性規律可幫助診斷急性戊型肝炎。通過后期動態隨訪，2例血清抗-HEV IgM、IgG和HEV RNA均陰性患者轉變為抗-HEV IgM和IgG雙陽性，因此也被診斷為AHE。然而，通過本研究患者起病時和后期的隨訪數據可以發現，有一部分患者不管是急性期還是恢復期僅能檢測到抗-HEV IgG，對于檢測不到抗-HEV IgM，而僅抗-HEV IgG陽性的患者，該如可評價呢？

目前，國內外對于抗-IgG陽性作為臨床診斷AHE的意義認識不盡相同[3，4，18]。有認為部分戊型肝炎患者血清抗HEV IgG持續時間較長，可長達數年之久，而且在正常人也可能由于過去感染而有3%～9%以上的低滴度陽性人群，故只有抗HEV IgG由陰轉陽或血清滴度有4倍以上升高時才有診斷意義。然而，抗 HEV IgG陽轉或滴度有4倍及以上升高，這一指標需定檢測雙份血清，不利于早期診斷，并且HEV感染的潛伏期相對較長，多數患者就診時IgG抗體常已陽轉并達到了較高的水平，因此該指標用于診斷AHE的實用性較差。有研究發現AHE時IgG陽性率可達86.5%(96/111)，持續時間短，恢復期僅6.3%(21/32)陽性，故可用于戊型肝炎的診斷，一次陽性即有意義。在臺灣13例AHE患者、271例健康人和160例其它肝病患者，采用RT-PCR法檢測血清HEV RNA，采用ELISA法檢測血清抗-HEV IgM和IgG，結果血清抗-HEV IgM和IgG診斷AHE的敏感性分別為92.1%和 98.6%，而特異性分別為92.1%和98.6%，認為抗-HEV IgG對診斷HEV感染的敏感性和特異性較抗-HEV IgM更好，與HEV RNA有良好的一致性[19]。有人檢測7個城市143例散發性AHE患者急性期血清抗-HEV IgM和IgG的陽性率分別為 100.0%和73.4%，抗-HEV IgM陽性血清其抗-HEV IgG均為陽性，未見單獨-HEV IgM陽性者。抗-HEV IgG于發病2周陽性率為93.9%，認為抗-HEV IgG作為診斷AHE的指標較抗-HEV IgM更有意義。本組72例患者血清學表現為單獨抗IgG陽性，但他們均有急性肝炎的臨床表現，并排除了藥物、酒精、代謝因素引起的肝損傷，也排除了其它噬肝病毒感染，如甲、乙、丙型肝炎病毒、巨細胞病毒和EB病毒感染，臨床可基本建立AHE診斷。為了進一步弄清抗-HEV IgG、抗HEV-IgM和HEV RNA在AHE病程不同時期的陽性檢出率，我們收集到138例有準確發病日期的患者血清，檢測發現了抗-HEV IgM、IgG和HEV RNA變化的規律，結果提示血清HEV RNA總陽性檢出率僅為17.4%，且在血清中存在時間短，主要集中在發病1周內。相對于血清抗HEV-IgM，抗-HEV IgG在病程的不同時期陽性檢出率更高，抗-HEV IgG在發病早期即可檢測出。本組血清抗-HEV IgG在發病第1周陽性檢出率就達90.2%，并且隨時間延長檢出率逐漸增高，在第4病周可達100%。由此可見，血清抗-HEV IgG對診斷AHE的敏感性明顯高于HEV RNA或抗HEV-IgM，對于單獨IgG陽性且有急性肝炎表現的肝炎患者，在能排除其他病因導致的肝炎后，可臨床診斷為AHE。