血清miR-32-5p、miR-409-3p表達在宮頸癌診斷和預后中的臨床價值

付芳華

上海中醫藥大學附屬第七人民醫院婦產科，上海 200137

宮頸癌是常見的女性腫瘤，在我國每年確診病例達13萬，占全球總數的28.8%，其發病率占女性腫瘤的第2位，且其發病率逐年升高，呈年輕化趨勢[1]。部分宮頸癌的發生由子宮頸上皮內瘤變(CIN)轉變而來，CIN疾病的監測、早期鑒別CIN和宮頸癌對提高宮頸癌的預后具有重要臨床意義[2]。微小RNA(miRNA)是一種小分子非編碼RNA，約有1/3的人類基因被miRNA調控，與mRNA結合后調控機體靶基因功能，是腫瘤輔助診斷、疾病監測和療效評估的潛在腫瘤標志物。同時，由于血液中的miRNA十分穩定，經反復凍融和酸堿處理均能夠穩定存在，故血清miRNA可用于監測腫瘤發生、發展和預后[3]。有研究證實，多種腫瘤患者血清中miR-32-5p、miR-409-3p等miRNA存在異常[4-5]，本研究通過檢測宮頸癌患者血清miR-32-5p、miR-409-3p水平，觀察其在宮頸癌診斷和預后中的價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2015年1月至2016年12月在本院行宮頸癌手術切除的患者112例為宮頸癌組，均行病理確診，年齡35～79歲，平均(53.61±14.64)歲；腫瘤單發41例，多發71例；按照國際婦產科協會(FIGO)分期：Ⅰ期25例，Ⅱ期33例，Ⅲ期32例和Ⅳ期22例。選擇同期在本院就診確診為CIN的患者72例為CIN組，年齡32～79歲，平均(54.17±12.37)歲，其中CIN Ⅰ期31例，CIN Ⅱ期25例和CIN Ⅲ期16例。另選擇同期在本院體檢健康者45例為健康對照組，年齡34～79歲，平均(53.72±12.75)歲。研究對象均簽署知情同意書，本研究經醫院倫理委員會審核通過。排除標準：其他惡性腫瘤；炎癥性、血液性和免疫性疾??；孕婦和哺乳期婦女；智力低下或精神障礙。3組研究對象一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1血液標本保存與檢測 在入組健康體檢者體檢時，以及患者入院后和手術后1周分別抽取肘靜脈血2 mL。采用離心機將血液離心，離心半徑15 cm，離心速度3 000 r/min，離心15 min，抽取上清液放置在除酶管內，置于-70 ℃冰箱中保存。血清人絨毛膜促性腺激素(β-HCG)、血清糖類抗原(CA)125標本采用酶聯免疫吸附試驗法檢測。

1.2.2血清總RNA的提取和miRNA的檢測 受試者血清400 μL，采用TaqMan miRNA試劑盒提取血清總RNA，反轉錄引物由上海化生有限公司合成。miR-409-3p上游引物序列：5′-GCG AAT GTT GCT CGG TGA-3′；下游引物序列：5′-GTG CAG GGT CCG AGG T-3′。miR-32-5p上游引物序列：5′-GGA GAU AUU GCA CAU UAC UA-3′；下游引物序列：5′-UUA GUG UGU GUG AUA UUU UC-3′。U6上游引物序列：5′-GTG CTC CCT GCT TCG GCA GCA-3′；下游引物序列：5′-AAA AAT ATG GAA CGC TTC ACG AAT TTG-3′。

選擇反轉錄酶1 μL、RNA 5 μL和3 μL引物，在15 μL的反應體系中，采用美國ABI TaqMan PreAmp Master Mix進行擴增，擴增條件為：在16 ℃ 30 min，42 ℃反應30 min和85 ℃反應5 min。反轉錄配制20 μL反應體系，放置在熒光定量儀中進行反應，反應條件為：95 ℃預變性為15 min，94 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，連續40個循環。每個樣品檢測3次，以2-ΔΔCt表示。

1.2.3觀察指標 觀察各組血清miR-32-5p、miR-409-3p、β-HCG和CA125水平的變化，以及血清miR-32-5p、miR-409-3p水平與臨床指標、診斷和預后的關系。

2 結 果

2.13組血清miR-32-5p、miR-409-3p、β-HCG和CA125水平變化 宮頸癌組術前血清miR-32-5p、β-HCG水平明顯高于CIN組和健康對照組(P<0.05)，CIN組明顯高于健康對照組(P<0.05)，宮頸癌組術后血清miR-32-5p、β-HCG水平較術前明顯降低(P<0.05)。宮頸癌組術前血清miR-409-3p水平明顯低于CIN組和健康對照組(P<0.05)，CIN組明顯低于健康對照組(P<0.05)，宮頸癌組術后血清miR-409-3p水平較術前明顯升高(P<0.05)。宮頸癌組術前、CIN組、健康對照組血清CA125水平差異無統計學意義(P>0.05)。 見表1。

2.2血清miR-32-5p、miR-409-3p、β-HCG診斷宮頸癌的效能 血清miR-32-5p(P<0.05)和miR-409-3p(P<0.05)診斷宮頸癌的效能明顯優于β-HCG(P<0.05)。將血清miR-32-5p和miR-409-3p水平進行二元Logistic回歸，方程式為Y=1.480XmiR-32-5p-1.972XmiR-409-3p+0.187，miR-32-5p和miR-409-3p聯合檢測的靈敏度為84.8%，特異度為83.3%，曲線下面積(AUC)為0.916，明顯高于miR-32-5p(P<0.05)和miR-409-3p(P<0.05)單項檢測。 見表2。

表1 3組血清miR-32-5p、miR-409-3p、β-HCG和CA125水平變化

表2 血清miR-32-5p、miR-409-3p、β-HCG診斷宮頸癌的效能

2.3血清miR-32-5p、miR-409-3p與臨床指標的關系 宮頸癌患者血清miR-32-5p、miR-409-3p與病理分級、淋巴結轉移、淋巴血管浸潤和FIGO分期具有相關性(P<0.05)，而與年齡、腫瘤直徑和腫瘤數目無相關性(P>0.05)。 見表3。

2.4血清miR-32-5p、miR-409-3p與3年內出現死亡的關系 112例宮頸癌患者3年內死亡33例(死亡組)，存活79例(生存組)。生存組血清miR-32-5p水平明顯低于死亡組(P<0.05)，而血清miR-409-3p水平明顯高于死亡組(P<0.05)。見表4。

表3 血清miR-32-5p、miR-409-3p與臨床指標的關系

2.5血清miR-32-5p、miR-409-3p預測宮頸癌3年內出現死亡的效能 血清miR-32-5p、miR-409-3p對預測宮頸癌3年內出現死亡具有較高的效能，2個指標經二元Logistic回歸，方程式為Y=1.027XmiR-32-5p-3.691XmiR-409-3p+0.258，miR-32-5p和miR-409-3p聯合檢測的靈敏度為75.8%，特異度為93.7%；AUC為0.881，明顯高于miR-32-5p(P<0.05)和miR-409-3p(P<0.05)單項檢測。見表5。

表4 血清miR-32-5p、miR-409-3p與3年內出現死亡的關系

表5 血清miR-32-5p、miR-409-3p表達預測宮頸癌3年內出現死亡的效能

3 討 論

miRNA是一類非編碼小分子RNA，由于在血液中高度穩定，在反復凍融和酸堿等惡劣環境中仍然保持穩定，故已逐漸被運用到臨床診斷和預后判斷[6]。有研究證實，miRNA在宮頸癌的增殖、分化和凋亡等病理生理過程中具有重要作用，并且在判斷預后方面具有重要臨床意義[7]。本研究結果顯示，宮頸癌組術前血清miR-32-5p水平明顯高于CIN組和健康對照組，術后宮頸癌患者血清miR-32-5p水平明顯降低，說明血清miR-32-5p與腫瘤組織具有相關性。本研究結果顯示，當血清miR-32-5p>2.52時，其診斷宮頸癌的靈敏度為81.2%，特異度為79.2%，AUC為0.854，明顯高于傳統指標β-HCG的診斷效能，說明血清miR-32-5p對宮頸癌具有較高的診斷效能。本研究結果顯示，血清miR-32-5p與病理分級、淋巴結轉移、淋巴血管浸潤和FIGO分期具有相關性，說明miR-32-5p參與了宮頸癌疾病的發生、發展過程，與文獻報道一致[8]。已知miR-32-5p在多種腫瘤的發生、發展中具有重要作用，并且具有雙重調節作用，在不同的腫瘤中可以是抑癌基因也可以是促癌基因[9-10]。在前列腺癌[4]和結腸癌[11]細胞的研究中證實其表達出現上調，并且與腫瘤的耐藥性具有密切相關性，但其關于宮頸癌的研究鮮見報道。本研究隨訪發現，3年內出現死亡的患者血清miR-32-5p水平明顯高于存活組患者，說明miR-32-5p與宮頸癌的預后具有密切相關性。本研究進一步發現，血清miR-32-5p預測3年內發生宮頸癌具有較高的預測效能，當血清miR-32-5p>4.17，其診斷宮頸癌的靈敏度為60.6%，特異度為89.9%，AUC為0.786，說明血清miR-32-5p對宮頸癌3年內出現死亡具有較高的預測價值，是宮頸癌預后的重要指標。

本研究結果顯示，宮頸癌組術前血清miR-409-3p水平明顯低于CIN組和健康對照組，術后宮頸癌患者血清miR-409-3p水平較術前明顯升高，說明miR-409-3p是宮頸癌患者的保護基因，對癌癥的發生、發展具有保護作用，與文獻報道一致[12]。在診斷宮頸癌方面，血清miR-409-3p診斷宮頸癌的效能明顯高于β-HCG，其靈敏度為92.0%，特異度為75.0%，AUC為0.817，并且其水平與病理分級、淋巴結轉移、淋巴血管浸潤和FIGO分期具有相關性，說明miR-409-3p具有抑制腫瘤發生、發展的作用，與腫瘤的生物學特性具有明顯相關性?，F已知miR-409-3p能夠通過調節纖維蛋白原B水平和調節血管內皮或血管內皮生長因子來影響血管的生長和腫瘤的生長及轉移[13-14]，此外，miR-409-3p還可以通過抑制血管素的表達從而抑制腫瘤血管的生成和新陳代謝[15]。在一項乳腺癌的研究中發現，miR-409-3p呈低表達，并且通過降低AKT1的基因表達，達到抑制腫瘤增殖和侵襲的效果[16]。本研究結果顯示，宮頸癌患者隨訪3年，死亡組血清miR-409-3p水平明顯低于存活組，說明血清miR-409-3p與宮頸癌預后具有重要聯系。進一步分析與預后的關系發現，血清miR-409-3p≤1.24時，與3年內出現死亡具有相關性，其診斷宮頸癌的靈敏度為69.7%，特異度為86.1%，說明miR-409-3p是判斷宮頸癌預后的重要指標。

本研究結果顯示，miR-32-5p和miR-409-3p聯合檢測對宮頸癌具有更高的診斷效能，明顯高于單項檢測，其靈敏度為84.8%，特異度83.3%，其效能的提高可能與miR-32-5p和miR-409-3p之間具有互補性有關，miR-32-5p類似癌基因促進腫瘤的進展，而miR-409-3p類似抑癌基因抑制腫瘤的進展，當兩者某種平衡打破后就可能出現腫瘤的增殖或者退縮，但其具體機制需要進一步研究。本研究結果還顯示，在預測3年內出現死亡方面，miR-32-5p和miR-409-3p聯合檢測明顯優于單項檢測，其診斷宮頸癌的靈敏度為75.8%，特異度為93.7%，AUC為0.881，明顯提高了診斷效能。故miR-32-5p和miR-409-3p聯合檢測不僅是診斷宮頸癌的重要指標，而且是預測預后的重要指標。