DNA-微陣列芯片檢測技術與Gene-Xpert MTB/RIF技術在新疆維吾爾自治區結核分枝桿菌耐藥性診斷中的應用

古麗娜·巴德爾汗，李遠春，阿依努爾·莫合買提，王 樂，劉年強△

1.新疆維吾爾自治區疾病預防控制中心結核病/麻風病防治中心，新疆烏魯木齊 830002；2.北京醫院呼吸與危重癥學科，北京 100730

結核病是造成人類死亡最多的慢性呼吸道傳染病，我國是全球22個結核病高負擔國家之一，結核病負擔位居全球第2位[1]。新疆維吾爾自治區是全國結核病疫情較為嚴重的地區，結核病感染率高，經濟欠發達，加之交通不便，嚴重制約著對結核病的防治，另外，隨著新疆維吾爾自治區耐藥結核病患者的增多，結核病防治工作更為艱巨。目前，新疆維吾爾自治區結核分枝桿菌耐藥性檢測主要應用比例法藥敏試驗，但該方法對實驗室操作環境及實驗人員技術水平要求較高，并且獲得藥敏結果的時間較長，不能及時對臨床進行用藥指導。隨著分子生物學技術的快速發展，越來越多的分子診斷技術應用于結核分枝桿菌耐藥性檢測，DNA-微陣列芯片檢測技術(以下簡稱基因芯片技術)和利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術(Gene-Xpert MTB/RIF技術)是其中2種方法，這2種技術較傳統培養法能夠在短時間內較為準確地鑒定結核分枝桿菌并檢測其耐藥性，可以較早、較準確地指導結核病患者的臨床用藥。

本研究選擇2015年新疆維吾爾自治區耐藥監測菌株，經轉錄間隔序列菌種鑒定后，以比例法藥敏試驗結果為耐藥檢測“金標準”，評價基因芯片技術及Gene-Xpert MTB/RIF 技術對結核分枝桿菌菌種鑒定和耐藥性診斷的效能，為后期在新疆維吾爾自治區全面開展分子診斷技術提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1材料 選取2015年新疆維吾爾自治區耐藥監測的120例疑似結核分枝桿菌感染者的臨床分離株，菌株按各地區上交菌株比例隨機納入，其中喀什地區31株，和田地區23株，伊犁地區19株，克州地區17株，阿克蘇地區12株，阿勒泰地區10株，烏魯木齊市4株，吐魯番和克拉瑪依市各2株。經16～23 S rDNA轉錄間隔序列測序鑒定其中115株為結核病患者菌株，5株為非結核病患者菌株，故本研究最終納入分析的為115株結核分枝桿菌臨床分離株。所有菌株均有異煙肼和利福平的表型藥敏試驗結果，基因芯片技術和Gene-Xpert MTB/RIF技術檢測結果也均為陽性。在115例結核病患者中，男56例(48.70%)，女59例(51.30%)；年齡19～84歲，平均(54.32±16.28)歲；初治65例(56.52%)，復治50例(43.48%)。

1.2羅氏固體培養基比例法藥敏試驗 改良羅氏培養基、利福平和異煙肼含藥改良羅氏培養基均為自制。用于比例法藥敏試驗的利福平和異煙肼含藥培養基藥物終濃度分別為40.0 μg/mL和0．2 μg/mL。首先將菌懸液配制成1 mg/mL，再稀釋成10-2、10-4mg/mL 2個濃度，分別接種于利福平和異煙肼含藥改良羅氏培養基上。所有操作均按照中國防癆協會基礎專業委員會制訂的《結核病診斷實驗室檢驗規程》[2]進行。本試驗使用的利福平和異煙肼均為美國Sigma公司產品(批號分別為080M1506V和060M0090) 。質控菌株為結核分枝桿菌標準菌株H37RV，來自中國疾病預防控中心結核病預防控制中心國家結核病參比實驗室。

1.316～23 S rDNA轉錄間隔序列測序 用10.0 μL接種環刮取羅氏固體培養基上生長的菌株約1/2環，水煮法提取DNA，-20 ℃保存備用。將分枝桿菌核酸1.0 μL，引物1為1.0 μL，引物2為1.0 μL，2×MIX 12.5 μL混合配制成28.0 μL的反應體系。將上述混合物于94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，63 ℃復性1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃延伸5 min。測序上游引物：5′-GAA GTC GTA ACA AGG TAG CCG；下游引物：5′-GAT GCT CGC AAC CAC TAT CYA[3]，分別位于上游16 S rDNA的末端和16～23 S rDNA 轉錄間隔序列保守區。引物的合成及擴增產物的純化和測序均由北京擎科生物有限公司完成。

1.4基因芯片技術檢測 取出PCR擴增試劑，自然解凍后搖勻，分裝反應體系，分別介入2.0 μL標本核酸溶液，按照耐藥PCR擴增程序進行檢測。進行芯片雜交及洗滌，運行結核耐藥芯片雜交程序，條件50 ℃雜交2 h，轉速5 r/min，預熱芯片洗干儀，待顯示“請放入芯片進行洗滌”對話框，放入雜交芯片，按照提示操作，確認甩干。開始掃描，由系統判讀結果?；蛐酒瑱z測系統及配套試劑均由北京博奧生物有限公司生產。

1.5Gene-Xpert MTB/RIF技術檢測 首先吸取保存菌液約1 mL放入15 mL的一次性無菌離心管中,再加入前處理液2 mL,擰緊蓋子用渦旋振蕩器振蕩30 s左右后,室溫靜置15 min,用無菌吸管吸取2 mL，由加樣孔緩慢加入試劑盒內,蓋緊試劑盒蓋后上機測試,由儀器自動判讀結果。Gene-Xpert MTB/RIF試劑盒為美國 Cepheid 公司產品。

2 結 果

2.1基因芯片技術檢測結核分枝桿菌對利福平的耐藥性 比例法藥敏試驗檢出利福平耐藥患者40例(34.78%)，基因芯片技術檢出利福平耐藥40例(34.78%)。以比例法藥敏試驗結果為“金標準”，基因芯片技術檢測結核分枝桿菌對利福平耐藥性診斷的靈敏度、特異度分別為80.00%、89.33%,陽性預測值、陰性預測值分別為80.00%、89.33%,準確度為86.87%,kappa值為0.693。將患者分為初治、復治2組分別分析，發現基因芯片技術檢測復治患者對利福平耐藥性的靈敏度和陽性預測值較高。基因芯片技術與比例法藥敏試驗檢測結核分枝桿菌對利福平耐藥性具有中度一致性，見表1。40例利福平耐藥標本中利福平rpoB基因耐藥位點分布為531(TCG→TTG)位點24例(60.0%)，526(CAC→TAC)位點3例(7.5%)，526(CAC→GAC)位點3例(7.5%)，511(CTG→CCG)位點5例(12.5%)，516(GAC→GTC)位點4例(10.0%)，513(CAA→AAA)位點1例(2.5%)。

表1 基因芯片技術檢測結核分枝桿菌對利福平耐藥性的診斷效能評價

表2 基因芯片技術檢測結核分枝桿菌對異煙肼耐藥性的診斷效能評價

2.2基因芯片技術檢測結核分枝桿菌對異煙肼的耐藥性 比例法藥敏試驗檢出異煙肼耐藥48例(41.74%)，基因芯片技術檢出異煙肼耐藥39例(33.91%)。以比例法藥敏試驗結果為“金標準”，基因芯片技術檢測結核分枝桿菌對異煙肼耐藥性診斷的靈敏度、特異度分別為77.08%、97.01%，陽性預測值、陰性預測值分別為94.87%、85.53%，準確度為88.70%，Kappa值為0.761，基因芯片技術和比例法藥敏試驗檢測結核分枝桿菌對異煙肼耐藥性有較高的一致性，見表2。39例異煙肼耐藥標本中異煙肼katG基因耐藥位點分布為315(AGC→ACC)位點31例(79.5%)，315(AGC→AAC)位點5例(12.8%)；異煙肼A基因耐藥位點分布為-15(C→T)位點2例(5.1%)，katG基因315(AGC→ACC)位點聯合異煙肼A基因-15(C→T)位點突變1例(2.6%)。

2.3Gene-Xpert MTB/RIF技術檢測結核分枝桿菌對利福平的耐藥性 比例法藥敏試驗檢出利福平耐藥40例(34.78%)，Gene-Xpert MTB/RIF技術檢測利福平耐藥41例(35.65%)例。以比例法藥敏試驗結果為“金標準”，Gene-Xpert MTB/RIF技術檢測結核分枝桿菌對利福平耐藥性診斷的靈敏度、特異度分別為92.50%、94.67%，陽性預測值、陰性預測值分別為90.24%、95.95%，準確度為93.91%，kappa值為0.867。Gene-Xpert MTB/RIF技術與比例法藥敏試驗檢測結核分枝桿菌對利福平的耐藥情況有較高的一致性。將患者分為初治、復治2組分別分析，發現Gene-Xpert MTB/RIF技術檢測復治患者對利福平耐藥性的靈敏度和陽性預測值較高。見表3。

表3 Gene-Xpert MTB/RIF技術檢測結核分枝桿菌對利福平耐藥性的診斷效能評價

2.4基因芯片技術與Gene-Xpert MTB/RIF技術檢測結核分枝桿菌對利福平耐藥性的診斷效能評價 115例基因芯片技術與Gene-Xpert MTB/RIF技術檢驗結果均為陽性的患者中，基因芯片技術檢出利福平耐藥40例(34.78%)，Gene-Xpert MTB/RIF技術檢出利福平耐藥41例(35.65%)例?；蛐酒夹g和Gene-Xpert MTB/RIF技術對利福平耐藥患者的診斷效能比較見圖1。檢驗結果顯示,2種分子生物學檢測方法對利福平耐藥患者的診斷效能差異無統計學意義(P>0.05)。

圖1 基因芯片技術與Gene-Xpert MTB/RIF技術檢測結核分枝桿菌對利福平耐藥性的診斷效能比較

2.5ROC曲線分析 以比例法藥敏試驗結果為參照標準，繪制基因芯片技術與Gene-Xpert MTB/RIF技術檢測結核分枝桿菌對利福平耐藥性的ROC曲線?；蛐酒夹gROC曲線下面積為0.850±0.040，Gene-Xpert MTB/RIF技術ROC曲線下面積為0.936±0.020，Gene-Xpert MTB/RIF技術ROC曲線下面積大于基因芯片技術，2種方法曲線下面積差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 基因芯片技術與Gene-Xpert MTB/RIF技術檢測結核分枝桿菌對利福平耐藥性的ROC曲線

3 討 論

我國是全球27個耐多藥結核病高負擔國家之一。利福平與異煙肼作為最重要的一線抗結核藥物組合，快速檢測結核分枝桿菌對利福平與異煙肼的靈敏度對指導臨床治療用藥具有重要意義。近年來，隨著分子生物學理論與技術的不斷發展，一些分子生物學診斷技術也逐漸用于臨床結核病的診斷和指導治療。Gene-Xpert MTB/RIF技術和基因芯片技術均為WHO批準并推薦用于肺結核診治的分子生物學診斷技術[4]。

基因芯片技術通過檢測標本中結核分枝桿菌的rpoB、katG和異煙肼A基因的突變情況，判定其對利福平和異煙肼的耐藥性，具有快速、簡便、高通量等特點，一次能夠同時檢測十幾至幾十個基因位點，適用于多位點分析，其靈敏度、特異度及準確度已得到臨床廣泛認可[5-7]。本研究中，基因芯片技術對利福平耐藥檢測的靈敏度為80.00%，特異度為89.33%，準確度為86.87%，對異煙肼耐藥檢測的靈敏度為77.08%，特異度為97.01%，準確度為88.70%，具有較高靈敏度及準確度，其結果與比例法藥敏試驗具有中度一致性，與目前報道的研究結果基本一致[8-9]。

Gene-Xpert MTB/RIF技術是集標本處理、DNA提取、核酸擴增、結核分枝桿菌特異核酸檢測、利福平耐藥基因rpoB突變檢測于一體的結核病和耐藥結核病快速診斷方法，是WHO推薦的結核分子生物學檢測技術之一，全過程只需約2 h，耗時短，操作簡單，無生物安全需求[5]。本研究中，Gene-Xpert MTB/RIF技術對利福平耐藥檢測的靈敏度、特異度分別為92.50%、94.67%。以往研究表明，Gene-Xpert MTB/RIF技術診斷利福平耐藥的靈敏度為92.9%～98.2%，特異度為95.5%～98.7%[6-7]，與本研究結果基本一致。

利福平發揮抑菌和殺菌作用的機制為作用于結核分枝桿菌DNA依賴的RNA聚合酶的β亞單位，干擾轉錄的開始及RNA的延伸。95.0%對利福平耐藥菌株的突變發生在rpoB 基因81 bp的熱點區域(編碼密碼子為507～533位)， 該區域被稱為利福平耐藥決定區，85.0%耐藥菌株出現531位Ser、526位His和516位Asp基因變異[10]。本研究采用結核分枝桿菌耐藥試劑盒檢測rpoB基因利福平耐藥決定區的531、526、511、516、513位密碼子，結果顯示，新疆維吾爾自治區531突變位點為優勢突變位點，其中531位點占60.0%，526位點占7.5%，與相關研究結果相似[11-12]。

異煙肼主要作用于細胞壁中的分枝菌酸、DNA、脂類等成分。在耐異煙肼的結核分枝桿菌分離株中有50%～90%的katG基因發生突變，另一個與耐藥性密切相關的基因為異煙肼A基因，該基因突變致結核分枝桿菌異煙肼耐藥比例為3%～30%[13]。本研究采用結核分枝桿菌耐藥試劑盒檢測katG基因的315位密碼子和異煙肼A基因的-15 位密碼子，結果顯示，新疆維吾爾自治區katG基因突變占主導地位(92.3%)，占絕對優勢，異煙肼A基因突變占次要地位(5.1%)。katG基因315位點為絕對優勢突變位點(92.3%)，與相關研究結果不一致[12-14]，可能的原因為本研究是以比例法藥敏試驗為“金標準”，而其他研究多采用Bactec MGIT960液體培養法或DNA測序為判斷標準，除此之外，基因突變位點也存在地域性差異，以往研究結果顯示，不同地區結核分枝桿菌耐異煙肼相關基因的突變類型和比例不同，因此，其耐多藥結核病快速診斷試劑盒的檢測結果不同[10]。

本研究中，基因芯片技術和Gene-Xpert MTB/RIF技術檢測結核分枝桿菌對利福平耐藥檢測的靈敏度和特異度均高于異煙肼。基因芯片技術、Gene-Xpert MTB/RIF技術檢測利福平耐藥的工作原理均為測定結核分枝桿菌的rpoB基因突變。有文獻報道，利福平耐藥結核分枝桿菌的rpoB基因突變率為95.0%[15]，異煙肼耐藥的結核分枝桿菌分離株其katG和異煙肼A基因操縱子的突變比例只占80.0%，小于rpoB基因在利福平耐藥中的比例；KatG與異煙肼A基因中除本研究選擇的315及-15位點外，極少數其他位點突變也可能引起異煙肼耐藥[16]。此外，陸續發現新的異煙肼耐藥相關基因，如ahpC，但基因芯片技術并不能檢測該耐藥相關基因的突變情況。故基因芯片技術和Gene-Xpert MTB/RIF技術檢測方法對利福平耐藥的檢測效能稍高于對異煙肼的檢測效能。Gene-Xpert MTB/RIF技術檢測利福平耐藥診斷效能稍高于基因芯片技術(ROC曲線下面積0.936vs. 0.850)，可能的原因為Gene-Xpert MTB/RIF技術是一體化操作，包括痰標本處理、DNA提取、核酸擴增、結核分枝桿菌特異核酸檢測、利福平耐藥基因rpoB突變檢測等，與手工處理相比標準化程度更高。

新疆維吾爾自治區經濟欠發達，農村地區生存條件嚴苛，結核病是主要的傳染病之一。據2000年全國第四次結核病流行病學抽樣調查結果顯示，新疆維吾爾自治區結核病患病率、涂陽患病率和死亡率分別是 464/10萬和160/10萬和 38/10萬，分別是全國平均水平的1.26、1.51和3.88 倍。2010年全國第五次結核病流行病學抽樣調查報告顯示，新疆維吾爾自治區15歲以上人群活動性肺結核患病率達1 576/10萬，南疆喀什地區高達2 727/10萬，其中農牧民患者占72.5%，農村居民患病率是城市的3倍[16]。新疆維吾爾自治區結核病患者發病率高，農村人口多于城市人口，分布較廣，迫切需要結核耐藥快速診斷方法以指導患者的治療。

常規使用傳統培養和藥敏試驗檢測結核分枝桿菌的耐藥性,通常需要8～12周的時間 ，Bactec MGIT960液體培養和藥敏試驗也需要2～4周的時間?；蛐酒夹g和Gene-Xpert MTB/RIF技術運用多重PCR擴增和反向雜交原理，通過檢測結核分枝桿菌相關耐藥基因的突變情況，可在2～4 h內診斷出結核分枝桿菌對利福平和異煙肼的耐藥性[17]。Gene-Xpert MTB/RIF技術操作簡單，檢測一體化程度高，對檢測人員要求較低，適合在新疆維吾爾自治區廣泛推廣。基因芯片技術與Gene-Xpert MTB/RIF技術相比，檢測的耐藥范圍更廣。這2種分子生物學技術縮短了獲取一線抗結核藥物藥敏結果的時間，對指導患者尤其是新疆維吾爾自治區耐多藥患者的治療有重大意義。

本研究中也有一些不足：由于成本問題，本研究入選標本數量相對不足，在耐藥性評價中存在一定局限性；2種分子生物學技術所檢測耐藥基因位點有所不同，基因芯片技術覆蓋面相對較廣且清晰，而Gene-Xpert MTB/RIF技術僅能定性檢測是否為利福平耐藥，無法對基因芯片相關的基因突變型進行驗證；本研究未評價3種耐藥檢測方法的效益與成本。