多重耐藥肺炎克雷伯菌的整合子-基因盒分布研究

胡海珍，朱國(guó)萍，李小寧△

1.皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院檢驗(yàn)科，安徽蕪湖 241000；2.安徽師范大學(xué)，安徽蕪湖 241000

肺炎克雷伯菌屬于腸桿菌科中的克雷伯菌屬，該菌廣泛存在于自然界中，是一種常見(jiàn)的條件致病菌。肺炎克雷伯菌易對(duì)藥物產(chǎn)生耐藥性，且耐藥率在升高，其耐藥機(jī)制比較復(fù)雜。隨著抗菌藥物的廣泛使用，容易造成體內(nèi)菌群失調(diào)，引發(fā)肺部炎癥、肝膿腫、泌尿系統(tǒng)感染等疾病[1-2]，已經(jīng)出現(xiàn)了多重耐藥、廣泛耐藥的肺炎克雷伯菌感染，給臨床抗感染治療帶來(lái)挑戰(zhàn)。

整合子是常見(jiàn)的可移動(dòng)遺傳元件，具有捕獲并整合外來(lái)基因盒的新型DNA元件，是一種天然復(fù)制的表達(dá)載體，具備基因盒的遺傳結(jié)構(gòu)及位點(diǎn)重組系統(tǒng)，通過(guò)對(duì)外來(lái)基因進(jìn)行切除和整合，從而獲取耐藥基因，同時(shí)，在上游的啟動(dòng)子作用下使其表達(dá)[3-4]。它通過(guò)獲取耐藥基因盒的方式，使自身的位點(diǎn)特異性基因重組，將多種耐藥基因組裝在一起造成耐藥基因擴(kuò)散，使細(xì)菌具有耐藥性，甚至是多重耐藥性[5]。隨著越來(lái)越多的新藥研發(fā)，抗菌藥物的廣泛使用，細(xì)菌耐藥基因盒的類型逐漸增多，最終導(dǎo)致更多復(fù)雜的耐藥菌出現(xiàn)[6]。因此，從分子機(jī)制上研究整合子-基因盒介導(dǎo)耐藥形成的原因，顯得尤為重要。本研究擬采用PCR擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)蕪湖地區(qū)整合子-基因盒在肺炎克雷伯菌中的分布情況，分析肺炎克雷伯菌菌株中含有的耐藥基因盒，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1菌株收集 收集2018年6月至2019年8月105株經(jīng)Vitek2全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀鑒定為肺炎克雷伯菌菌株的分離株，均來(lái)自皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院，編號(hào)依次為1～105。按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第4版[7]操作流程對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)。

1.1.2藥敏試驗(yàn) 采用Vitek2全自動(dòng)微生物分析鑒定儀對(duì)105株肺炎克雷伯菌分離株進(jìn)行細(xì)菌再次鑒定及藥敏試驗(yàn)，對(duì)藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行初步篩查。多重耐藥菌株的判斷標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)青霉素類、頭孢菌素類、碳青霉烯類、氨基糖苷類、喹諾酮類中的3類或3類以上耐藥的菌株，即為多重耐藥菌株。產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)的肺炎克雷伯菌的判斷標(biāo)準(zhǔn)：ESBLs可以水解滅活青霉素類、頭孢菌素類；一般對(duì)青霉素類抗菌藥物及碳青霉烯類抗菌藥物無(wú)水解作用；活性可被舒巴坦、克拉維酸等復(fù)合制劑所抑制。耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(CRKP)的判斷標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物(如亞胺培南、美羅培南等)耐藥的菌株。

1.2儀器與試劑 引物序列根據(jù)參考文獻(xiàn)[8]由安徽通用生物有限公司設(shè)計(jì)合成，見(jiàn)表1。瓊脂糖凝膠購(gòu)自安徽通用生物有限公司，PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司，電泳儀購(gòu)自北京六一儀器廠，凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Biorad公司，Vitek2微生物鑒定分析儀購(gòu)自法國(guó)Biomerieux公司。

1.3方法

1.3.1模板制備 將收集的菌種用三區(qū)劃線法接種在血平板上，放入培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng) 24 h；用滅菌過(guò)的接種針蘸取單個(gè)菌落后，將其接種于盛有肉湯的EP管中，隨后放入37 ℃搖床中增菌后待用。

表1 引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.3.2整合子檢測(cè) PCR反應(yīng)體系共 20.0 μL：DNA 模板 1.0 μL，引物(整合酶Ⅰ、整合酶Ⅱ或整合酶Ⅲ)0.8 μL,綠酶(M7822 GoTaq G2 Green Master Mix)10.0 μL，滅菌水8.2 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，60、54、52 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。1%瓊脂凝膠：用電子天平稱取0.6 g瓊脂糖加入燒瓶，往燒瓶中加入60 mL 1×TAE，用微波爐進(jìn)行多次短時(shí)間加熱，至瓊脂糖溶解且看不見(jiàn)任何絮狀物后，過(guò)涼水冷卻至55 ℃，加入6.0 μL EB搖晃至均勻后，緩慢倒入潔凈的模具中，傾倒過(guò)程中應(yīng)避免氣泡的產(chǎn)生，放置室溫中冷卻至凝固定型，待瓊脂凝固后可拔出梳子，備用。PCR產(chǎn)物各取5.0 μL進(jìn)行點(diǎn)樣并記錄位置，設(shè)電伏120 V，電泳30 min，電泳結(jié)束后，使用凝膠成像儀檢測(cè)。

1.3.3基因盒的檢測(cè) PCR反應(yīng)體系共50.0 μL：DNA模板4.0 μL，引物(整合子可變區(qū))4.0 μL，綠酶(M7822 GoTaq G2 Green Master Mix)18.0 μL，滅菌水24.0 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性4 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸5 min，34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。1%瓊脂凝膠：同1.3.2。PCR產(chǎn)物各取5.0 μL進(jìn)行點(diǎn)樣并記錄位置，設(shè)電伏120 V，電泳30 min，電泳結(jié)束后，使用凝膠成像儀檢測(cè)。

1.3.4擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序及分析 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送安徽通用生物有限公司測(cè)序。采用BLAST比對(duì)分析測(cè)序結(jié)果。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)分析采用Graphpad Prism 6.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1藥敏試驗(yàn) 105株肺炎克雷伯菌分離株依據(jù)耐藥性分類：非多重耐藥肺炎克雷伯菌有52株(49.5%)；多重耐藥肺炎克雷伯菌有53株(50.5%)，包括僅產(chǎn)ESBLs的肺炎克雷伯菌有35株，同時(shí)產(chǎn)ESBLs和CRKP肺炎克雷伯菌有18株。

2.2整合子檢測(cè)結(jié)果 在105株肺炎克雷伯菌分離株中，檢出Ⅰ類整合子61株(部分檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1)，檢出率為58.1%(61/105)，未檢出Ⅱ類和Ⅲ類整合子菌株。61株中有18株是同時(shí)產(chǎn)ESBLs和CRKP肺炎克雷伯菌,有20株是僅產(chǎn)ESBLs的肺炎克雷伯菌,有23株是非多重耐藥肺炎克雷伯菌。多重耐藥肺炎克雷伯菌的Ⅰ類整合子的檢出率(71.7%，38/53)明顯高于非多重耐藥肺炎克雷伯菌(44.2%，23/52)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004 3)。

2.3可變區(qū)基因盒測(cè)序結(jié)果 含有Ⅰ類整合酶的61株菌中，可變區(qū)的PCR擴(kuò)展后凝膠電泳并通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)顯像，其中有39株可見(jiàn)亮條帶，22株未見(jiàn)條帶。39株亮條帶中，非多重耐藥肺炎克雷伯菌有3株，僅產(chǎn)ESBLs的肺炎克雷伯菌有18株，同時(shí)產(chǎn)ESBLs和CRKP的肺炎克雷伯菌有18株。22株未見(jiàn)條帶中20株為非多重耐藥肺炎克雷伯菌，2株為產(chǎn)ESBLs的肺炎克雷伯菌。將39株P(guān)CR產(chǎn)物送至安徽通用生物有限公司測(cè)序，經(jīng)BLAST比對(duì)，有27株的基因序列比對(duì)出耐藥基因(27株菌株均對(duì)喹諾酮類耐藥，卻未檢出相應(yīng)的耐藥基因盒qnrVc1，其中有13株菌株對(duì)亞胺培南耐藥，卻未檢出相應(yīng)的耐藥基因盒blaKPC)，12株未比對(duì)出耐藥基因。共比對(duì)出5種耐藥基因：氨基糖苷類aadAl、aacA4、aadA2和磺胺類dfrA1、dfrA12。該39株耐藥表型及比對(duì)出的耐藥基因盒組合情況見(jiàn)表2。

注：M表示DNA Marker，陰表示陰性對(duì)照，22、23、25、26、29、31、32、33、34、35、38、39、40為擴(kuò)增結(jié)果陽(yáng)性條帶。

表2 39株可變區(qū)陽(yáng)性條帶的肺炎克雷伯菌檢測(cè)結(jié)果

續(xù)表2 39株可變區(qū)陽(yáng)性條帶的肺炎克雷伯菌檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

肺炎克雷伯菌引發(fā)肺炎、肝膿腫、泌尿系統(tǒng)等感染性疾病日益增多，非多重耐藥肺炎克雷伯菌引起的感染，給臨床抗感染治療帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)。研究肺炎克雷伯菌的耐藥機(jī)制，對(duì)于臨床醫(yī)生及時(shí)選擇有效的抗菌藥物起到很大的指導(dǎo)作用。目前，碳青霉烯類抗菌藥物是治療臨床上多重耐藥菌感染患者常用且有效的藥物。隨著此類藥物的大范圍不規(guī)范應(yīng)用，導(dǎo)致耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌不斷增多，尤其是CRKP。根據(jù)我國(guó)監(jiān)測(cè)報(bào)告，CRKP菌株的檢出率呈逐年上升趨勢(shì)，亞胺培南和美羅培南的耐藥率由2015 年的 15.6%和14.4%，上升至2017年的20.9%和24.0%[9-10]。

整合子是一類可以通過(guò)位點(diǎn)特異性重組方式捕獲、剪切、整合外源性耐藥基因的DNA元件，其被認(rèn)為是導(dǎo)致抗菌藥物抗性、毒性和致病性產(chǎn)生及擴(kuò)散的移動(dòng)元件[11]。其基本組成包括5′-保守末端、3′-保守末端及中間的可變區(qū)，可變區(qū)可在整合酶作用下插入一個(gè)或者多個(gè)耐藥基因盒，使得細(xì)菌表現(xiàn)出相應(yīng)耐藥特征。根據(jù)5′-保守末端中編碼整合酶IntⅠ基因的不同，整合子目前可以分為6類，最常見(jiàn)的是Ⅰ類整合子,其次是Ⅱ、Ⅲ類整合子。

基因盒通常是堿基數(shù)目較少的、可移動(dòng)的環(huán)狀DNA小分子，一般可單獨(dú)存在，通過(guò)整合酶及啟動(dòng)子的作用，基因盒才可能完成轉(zhuǎn)錄并表達(dá)。基因盒編輯的基因有限，所以一般不含有啟動(dòng)子，只有被整合子捕獲后并插入到整合酶基因上特殊的位點(diǎn)時(shí)才能依靠整合子上的啟動(dòng)子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄及表達(dá)。能夠整合到整合子上的基因盒主要為耐藥基因盒，一般由其所編碼的基因名字對(duì)其命名[12]。因耐藥基因盒可被自由剪切或整合，從而導(dǎo)致基因盒在細(xì)菌之間相互傳遞[13]。相關(guān)研究顯示，基因盒中最常見(jiàn)的是aadA和dfrA基因盒[14-15]。

本研究所收集的105株肺炎克雷伯菌分離株中，非多重耐藥肺炎克雷伯菌有52株(49.5%)，多重耐藥肺炎克雷伯菌有53株(50.5%)，53株中有35株是產(chǎn)ESBLs的肺炎克雷伯菌，剩余18株是同時(shí)產(chǎn)ESBLs和CRKP的肺炎克雷伯菌，本次收集標(biāo)本中無(wú)僅產(chǎn)CRKP的肺炎克雷伯菌，可見(jiàn)產(chǎn)CRKP的肺炎克雷伯菌同時(shí)對(duì)青霉素、頭孢類、喹諾酮類等有著較高的耐藥性。

通過(guò)對(duì)105株肺炎克雷伯菌分離株進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Ⅰ類整合子61株(58.1%)，未發(fā)現(xiàn)Ⅱ、Ⅲ類整合子菌株。61株中38株(62.3%)為多重耐藥肺炎克雷伯菌，23株(37.7%)為非多重耐藥肺炎克雷伯菌，由此可見(jiàn)，Ⅰ類整合子在多重耐藥和非多重耐藥肺炎克雷伯菌中的分布差異極為明顯，多重耐藥肺炎克雷伯菌分離株中Ⅰ類整合子的檢出率明顯高于非多重耐藥肺炎克雷伯菌。

本研究中對(duì)61株有Ⅰ類整合子菌株的可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠電泳試驗(yàn)后凝膠塊經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)顯示，有39株出現(xiàn)亮條帶，39株可變區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)基因比對(duì)，其中有27株比對(duì)出了5種耐藥基因，分別是磺胺類dfrA1、dfrA12和氨基糖苷類aadAl、aacA4、aadA2。結(jié)合菌株的耐藥表型結(jié)果分析，耐藥基因盒與耐藥表型有一定的相關(guān)聯(lián)系，但有些菌株表達(dá)了耐藥表型卻未檢出所對(duì)應(yīng)的耐藥基因盒，如27株菌株都對(duì)喹諾酮類耐藥，卻未檢出相應(yīng)的耐藥基因盒qnrVc1，其中有13株菌株對(duì)亞胺培南耐藥，卻未檢出相應(yīng)的耐藥基因盒blaKPC，說(shuō)明耐藥表型與耐藥基因盒不是完全對(duì)應(yīng)的，還需進(jìn)一步研究其他的耐藥機(jī)制。

綜上所述，蕪湖地區(qū)肺炎克雷伯菌以Ⅰ類整合子為主，未發(fā)現(xiàn)Ⅱ、Ⅲ類整合子，多重耐藥肺炎克雷伯菌較非多重耐藥肺炎克雷伯菌的整合子檢出率高，整合子可變區(qū)的攜帶基因盒與細(xì)菌耐藥性有著相關(guān)關(guān)系，耐藥基因和耐藥表型具有一致性，且細(xì)菌存在多種耐藥機(jī)制。根據(jù)研究結(jié)果顯示，芫湖地區(qū)肺炎克雷伯菌對(duì)氨基糖苷類及磺胺類抗菌藥物耐藥率較高，應(yīng)盡量避免此類抗菌藥物的使用。