多殺菌素影響下黑斑側褶蛙皮膚轉錄組分析

王愛麗 李娜 王金園 聶茂菊

（濰坊科技學院，山東壽光 262700）

0 引言

多殺菌素（Spinosad），又名刺糖菌素，是由好氧型革蘭氏陽性土壤放線菌刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）發酵液中提取的一種大環內酯類無公害高效生物殺蟲劑，沒有抑菌活性，但有殺蟲活性。其具有獨特的殺蟲機理，能夠有效地防治各種害蟲，且無交叉抗性，對大多非靶標動物都有極高的安全性等優點，且多殺菌素可較快地通過光和土壤微生物降解，因而不會造成環境風險。由于多殺菌素具有上述優點，所以，多殺菌素在蔬菜種植區應用廣泛[1]。

黑斑側褶蛙（Pelophylax nigromaculata），又名黑斑蛙，屬無尾目，蛙科，側褶蛙屬，是山東壽光地區常見蛙類之一。因其清晨及夜間大量捕食斜紋夜蛾、螻蛄、金花蟲等昆蟲，而成為經濟價值較大的蛙類之一[2]。黑斑側褶蛙水陸兩生環境復雜，對環境的依賴性大，環境的變化對他們的生長和進化都會產生很大的影響。本文擬對經過多殺菌素處理的皮膚組織進行轉錄組分析，找出差異基因顯著富集的通路，預測多殺菌素對黑斑側褶蛙皮膚的功能影響。

1 材料和方法

1.1 樣品處理和RNA 提取

本試驗樣品采集于山東省煙臺市昆崳山。黑斑側褶蛙10 只分成2 組，每組5 只標記養殖，其中對照組標記為c，處理組標記為n。處理組為用2.5%懸浮劑50 ～100 毫升稀釋多殺菌素溶液噴霧進行刺激的黑斑側褶蛙。對照組和處理組在完全相同的環境中生長，48 小時后搗毀脊髓法處理，取背部中央皮膚液氮保存備用。分別測定6 只黑斑側褶蛙皮膚轉錄組信息，序列比對，差異基因，差異抗菌肽分析。同時確定黑斑側褶蛙轉錄組序列發生改變的多殺菌素濃度為有效刺 激 濃 度。總RNA 用TRIzol（Invitgen，Carlsbad，CA，USA） 試 劑 提 取，260/280nm（A260/A280）和Agilent BioAnalyzer 2100（Agilent，上海，中國）測量吸光度來檢測RNA 樣品的完整性和質量。

李偉：順豐的并購邏輯其實很簡單，就是看順豐的市場戰略方向在哪里。像冷鏈、快運、航空快遞都是順豐的市場戰略，因為順豐的并購也在這幾個方向上。如果再剖析一下，我認為有2個點很關鍵。

看著家里的氣氛越來越緊張，兒子兒媳婦也很著急，可工作太忙沒辦法分擔，就想著早點給寶寶送去幼兒園，這樣也能讓我和老伴緩緩。我知道后第一個舉手贊同，可老伴不干，心疼小孫子太小，到幼兒園挨欺負。兒子兒媳婦說沒關系，我也說得鍛煉鍛煉，可無論我們怎么勸，老伴也不讓送，她一點也不考慮自己，更沒有考慮我的感受。

1.2 文庫的構建

（四）歷史悠久的巴渝文化。西沱鎮是一個歷史悠久的文化古鎮，形成了長江上游獨特的巴文化，分布著商周時期的觀音寺遺址、沙灣遺址等，有土家族風格的吊腳樓群與漢族傳統風格的古建筑群組成的云梯街。2003年11月被評為首批“中國歷史文化名鎮”，2008年被評選為“巴渝新十二景”之一。

1.3 測序數據質量控制與分析

總之，采用“產-教-學”深度融合的教學模式，充分調動起企業、教師、學生參與積極性，讓學生在校期間即可實現“學生-準職業人-職業人”的身份轉變，解決學生就業與企業的銜接問題，實現多方共贏的人才培養模式與校企合作培養模式。

1.4 DEGs 的篩選

對ORF 同Uniprot 數據庫比對結果，基因注釋到Uniprot、NR、NT 的 基 因 數 進 行 統 計。ORF 同Uniprot 數據庫共比對到比對18217 條結果，基因從NR 數據庫比對到32512 條基因，基因從NT 數據庫比對25821 條基因，從Uniprot 數據庫的比對結到25084 條基因。各數據庫共同注釋基因數為10945 條。

1.5 DEGs 表達模式的聚類分析

將差異表達的轉錄本映射到KEGG 數據庫（www.genome.jp/KEGG/） 進 行KEGG pathway 分 析， 該分析與數據進行GO 分析的方法相同。在KEGG 通路的分析中，使用經過FDR 校準后的Q 值作為篩選標準，Q ≤0.05 的通路被認定為顯著富集通路。

1.6 GO 和KEGG pathway 功能富集分析DEGs 表達模式的聚類分析

6 個的皮膚cDNA 文庫測序共獲得273945858 個raw reads。篩選獲得266625548 個clean reads，占所有樣品序列總數的98%以上。

轉錄本使用軟件Trinity 進行組裝得到同源的和（或）可變剪接形式的轉錄本。基于過濾后的Clean Data，用Trinity 組裝出全長轉錄本序列，并基于轉錄本序列，取每個基因中最長的轉錄本序列作為Unigene。利用Bowtie2（2.2.3 版）將用于組裝的序列與組裝后的轉錄本序列進行比對，使其定位到組裝轉錄本，然后統計比對上序列的Reads 比例。采用序列比對的方法對Trinity 組裝得到的全部轉錄本和Unigene 分別進行BUSCO 評估，核心蛋白比對率評估，準確性評估，注釋比例評估，Reads 利用率評估，利TransDecoder軟件進行開放閱讀框預測，然后基于Trinity 組裝的Unigene 序列和TransDecoder 預測得到的ORF 序列，通過Blast、HmmScan、SignalP、TmHMMP 等工具得到組裝結果在相應數據庫中的注釋信息，然后采用Trinotate（Trinotate Release v3.0.2）整合得到綜合的功能注釋結果。

將總RNA 隨機切割成短片段，以片段RNA 為模板合成具有隨機六聚體的第一鏈cDNA，然后加入緩沖dNTPs（dUTP 而 不 是dTTP），RnaseH， 用DNA 聚合酶Ⅰ合成第二鏈cDNA，用QiaQuick PCR 試劑盒純化，用EB 緩沖液洗脫。末端修復，堿基A 加上測序連接物，然后通過UNG（Uracil-N-Glycosylase，尿嘧啶-N-糖基化酶）鏈降解，連接產物通過PCR 擴增進行逆轉錄，產物富集生成cDNA 文庫，并使用Gene Denovo Biotechnology Co.的Illumina HiSeqTM 4000 進行測序。（中國廣州）

根據差異表達基因在每個樣品里的表達量，取以2 為底的對數后，計算歐氏距離，利用R 軟件（3.1.1版），對不同樣本的差異表達基因進行分層聚類分析。

2 實驗結果

2.1 測序數據匯總

使 用R package clusterProfiler 進 行GO terms 和KEGG pathways 富集分析。將差異表達的轉錄本富集到GO 數 據 庫（http://www.geneontology.org/）， 并計算每個術語的富集數，以獲得具有特定GO term 的轉錄本列表和富集數。

2.2 注釋結果

使用RPKM 估計基因表達值，使用DESeq2 對對照組和處理組之間的mRNA 進行差異表達分析。以q值和log2差異倍數作為標準進行差異表達轉錄本的篩選，閾值為|log2Ratio|≥1 和q＜0.05。

2.3 DEGs 基因的鑒定和分析

通過對DEGs 分析發現，對照組與處理組之間有1695 個差異表達基因，其中上調基因737 條，下調基因958 條。各小組差異基因聚類效果較好，可用于下一步的數據分析。

2.4 GO and KEGG pathway 分析

對DGEs 進行GO 和KEGG 富集分析，以進一步確認它們參與生物過程調控的功能。GO 分析結果顯示c-vs-n 差異基因富集結果中，得到4377 個GO 分類。contractile fiber part、myosin filament、Z disc是細胞組分Ontology 最顯著富集的三個通路。muscle contraction、muscle system process、striated muscle contraction 是生物過程Ontology 最顯著富集的三個通路。structural constituent of muscle 是分子功能Ontology 富集顯著程度最高的GO 條目。

KEGG 通路分析顯示，顯著富集的前4 條KEGG 通路分別是Antigen processing and presentation、Estrogen signaling pathway、IL-17 signaling pathway和MAPK signaling pathway，在這四條通路中Hsp70和Hsp90 均顯著上調。

與干預前比較，住院規培醫師采用薩提亞心理治療模式干預后SES總分升高，差異具有統計學意義（t=12.34，P＜0.05）；干預前后人際關系困擾得分比較，差異具有統計學意義（t=11.41，P＜0.05）（見表1）。

3 討論

隨著農藥使用量的逐年增加，農藥污染日益嚴重。生物化合物多殺菌素常用于農業和有機農業中以對抗害蟲[3]。全球兩棲類動物種群衰退現象十分嚴重，黑斑側褶蛙是壽光地區常見的兩棲動物，有研究證明這些年來，黑斑蛙的數量急劇減少[4]。

對照組和處理組差異基因顯著富集到muscle contraction、structural constituent of muscle 等條目中。而顯著富集的KEGG 通路則有四個，其中基因Hsp70、Hsp90 和IL-17 均上調。Hsp70、Hsp90 是一種熱休克蛋白，在應激條件下表達明顯增加[5]。IL-17 是T 細胞誘導的炎癥反應的早期啟動因子，與受體結合，通過MAP 激酶途徑和核轉錄因子kB（nuclearfactor kB，NF-kB）途徑發揮生物學作用[6]。我們預測多殺菌素的處理引起黑斑側褶皮膚細胞產生應激反應，誘導免疫相關因子表達水平的提高，從而提高了黑斑側褶蛙皮膚對外界農藥刺激的免疫反應。