超臨界二氧化碳萃取甘蔗糖蜜色素的工藝研究

羅勇為，唐林波，張平軍

(1廣東省科學院生物工程研究所，廣東廣州510316；2廣東省綠色制糖工程技術研究中心，廣東廣州510316；3桂林萊茵生物科技股份有限公司，廣西桂林541004；4桂林三金藥業股份有限公司，廣西桂林541200)

0 引言

甘蔗糖蜜色素是由甘蔗中原有色素和在制糖過程中形成的色素2部分組成，包括酚類色素、焦糖色素、美拉德色素和己糖堿性降解色素等，并最終將絕大部分累積于糖蜜中，因此，甘蔗糖蜜色素是含有多種色素成分的混合色素[1]。這些色素具有高附加值，其中焦糖色素廣泛應用于釀造、焙烤、糖果、飲料等行業，作為食品添加劑，具有色、香、味的強化功能且食用安全[2]。美拉德色素和酚類色素則具有抗氧化作用，同時還具有耐高溫等特點。從糖蜜中分離出色素是目前開發利用糖蜜資源重要的課題[3]。

甘蔗糖蜜中的弱極性色素濃度高、種類多、分子量分散，給色素回收及精制造成很大的困難，相關研究者對此已作了多方面的研究[1,4-5]，如有活性炭吸附法、膜分離法、樹脂法等。其中，活性炭吸附法和膜分離法用于制糖脫色單元成本較高；樹脂法相比活性炭法和膜分離法更經濟，具有較高的脫色性能，但樹脂不易再生且產生大量再生廢液。

超臨界流體萃取(Supercritical Fluid Extraction，SFE)是近代化工分離中出現的高新技術，將傳統的蒸餾和有機溶劑萃取結合一體[6-9]。通過改變壓力或溫度使超臨界流體的密度大幅改變。在超臨界狀態下，將超臨界流體與待分離的物質接觸，使其有選擇性地依次把極性大小、沸點高低和相對分子質量大小不同的成分萃取出來。超臨界CO2具有類似氣體的擴散系數、液體的溶解力，表面張力為 0，能迅速滲透進固體物質之中，提取其精華，具有高效、不易氧化、純天然、無化學污染等特點。目前，采用超臨界流體萃取技術提取甘蔗糖蜜色素的相關研究較少，本研究旨在對甘蔗糖蜜中色素類物質最佳萃取工藝條件和其抗氧化活性等方面進行研究，為未來的規模化生產提供理論支持和現實依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

濃縮的甘蔗糖蜜固形物含量約88%，取于廣東某糖廠；2，2-二苯基-1-三硝基苯肼(DPPH)，購于上海麥克林生化科技有限公司；CO2，純度＞99.9%，購于廣州嘉堯氣體科技有限公司；無水乙醇等其它試劑，購于廣州化學試劑廠。

1.2 實驗設備與儀器

SFE221-50-06型超臨界二氧化碳流體萃取儀，海安超臨界萃取儀器有限公司；LYOQUEST-55型冷凍干燥機，西班牙Telstar公司；TU-1901型紫外可見光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；BSA223S型分析天平，北京賽多利斯科學儀器有限公司；RE-2000A型旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；FlowMem0015型微孔濾膜設備，廈門福美科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 超臨界二氧化碳萃取的工藝條件

取100.0 g濃縮的甘蔗糖蜜物料，加入10.0 g粒徑為2 mm的玻璃珠，置于1 L萃取釜中，在單因素試驗的基礎上，選擇夾帶劑種類、夾帶劑用量、萃取溫度、萃取壓力、萃取時間以及二氧化碳流量等因素，然后，在45℃條件下，將萃取的色素依次經過蒸發濃縮和冷凍干燥，測定色率、紅色指數及抗氧化活性等相關指標[10-11]，研究分析超臨界二氧化碳萃取甘蔗糖蜜中色素的工藝。

實驗單因素水平如下：夾帶劑種類分別為乙醇、乙酸乙酯；夾帶劑質量濃度為 90%、80%、70%、60%、50%；萃取溫度為 25、35、45℃；萃取壓力為15、20、25、30、35 MPa；萃取時間為30、60、90、120、150 min；二氧化碳流速為15、20、25、30 L/h。

1.3.2 色率的測定

色率(或色價)，它表示該提取樣品顏色的深淺，可決定其在食品及飲料中的添加量。色率的測定：準確稱量1.00 g固體色素，以蒸餾水溶解，定容至1000 mL，然后經0.22 μm濾膜過濾，用紫外可見光光度計測定樣品的吸光值A610nm，平行3次，取平均值A1，計算EBC色度：

EBC單位的定義：稀釋定量濃度的樣品在波長610 nm下的吸光值為0.076，其色率為20000 EBC單位。

1.3.3 紅色指數的測定

紅色指數又稱色調，是表示色素中紅色物質含量多少的一個量，它表示了色素的色澤，該數值越高，所含紅色物質越多，其成品顏色亦越紅。紅色指數的測定：將上述1.3.2節的樣品，用紫外可見光光度計測定樣品的吸光值A610nm及A510nm，平行3次，計算平均值分別為A1、A2，紅色指數計算公式如下：

1.3.4 抗氧化能力的測定

DPPH法廣泛用于定量測定抗氧化能力。樣品DPPH自由基清除率的測定：取一定量的提取物，加入70%(V/V)的乙醇溶液后定容至100 mL，配成含萃取物的量為 20 ug/mL的樣液。稱取 20 mg DPPH，用無水乙醇定容至250 mL，濃度為2×10-4mg/L的DPPH乙醇溶液。分別吸取樣品溶液2 mL，加入DPPH乙醇溶液(2×10-4mg/L) 2 mL，搖勻后避光反應處置30 min，用分光光度計測定517 nm處的吸光度A樣品。同時，測定樣品溶液2.0 mL與乙醇2.0 mL混合液在517 nm處的吸光度A空白，再測定1.0 mL DPPH溶液與1.0 mL乙醇混合液在517 nm處的吸光度A對照。同一樣品重復測定3次。

2 結果與討論

2.1 夾帶劑種類對萃取色素的影響

常用的超臨界二氧化碳流體萃取夾帶劑有甲醇、乙醇及乙酸乙酯等，它們的極性從高至低的排序為：甲醇＞乙醇＞乙酸乙酯。由于甲醇具有中等毒性，所以選擇乙醇和乙酸乙酯進行對比試驗。夾帶劑∶色素按質量比為4∶1的比例混合，移至萃取釜，具體的萃取實驗條件為：二氧化碳流速設為20 L/h，萃取溫度為35℃，萃取壓力為20 MPa，萃取60 min，實驗結果見圖1所示。

根據圖1中數據，無添加夾帶劑(空白)和添加乙醇、乙酸乙脂夾帶劑萃取的色素色率分別為21000、29000、28500 EBC單位，色素的紅色指數分別為2.68、1.76、2.02。無添加夾帶劑(空白)與添加夾帶劑對比，添加夾帶劑萃取的色素色率顯著升高，而其紅色指數明顯降低。乙醇夾帶劑萃取產品的色率比乙酸乙酯萃取產品色率高500 EBC單位，表明乙醇夾帶劑萃取而得的有色物質比乙酸乙酯多，且乙醇夾帶劑萃取而得的有色物質DPPH自由基清除率達到74.2%(見表1)。在紅色指數方面，乙酸乙酯萃取色素比乙醇萃取色素高 12.9%。為提取糖蜜中有色物質，選擇乙醇夾帶劑進行后續實驗。

圖1 夾帶劑種類對萃取色素的影響

表1 不同夾帶劑對色素DPPH值的影響

2.2 夾帶劑濃度對萃取色素的影響

夾帶劑濃度變化，可影響萃取流體的極性。乙醇夾帶劑∶色素按質量比依次為9∶1、4∶1、7∶3、3∶2、1∶1的比例混合，即乙醇夾帶劑的質量濃度分別是90%、80%、70%、60%、50%，分別移至萃取釜，具體的萃取實驗條件為：二氧化碳流速設為20 L/h，萃取溫度為35℃，萃取壓力為20 MPa，萃取60 min。實驗結果見圖2所示。由圖2中可知，乙醇夾帶劑的質量濃度分別是 90%、80%、70%、60%、50%時，萃取色素的色率為 79800、28900、31000、40500、31600 EBC單位，萃取色素的紅色指數為 3.89、1.75、1.72、1.68、1.02。當乙醇夾帶劑質量濃度為 90%～60%時，隨著夾帶劑含量的減少，色率呈逐步上升趨勢，而當夾帶劑質量濃度為50%時，萃取產品的色率顯著下降，表明夾帶劑質量濃度為60%時，最適合萃取糖蜜色素中的有色物質。乙醇夾帶劑質量濃度用量為90%時，紅色指數為3.89，但當乙醇夾帶劑質量濃度少于80%，紅色指數均在1.80以下。為提取糖蜜中有色物質，選擇 乙醇夾帶劑質量濃度為60%進行后續實驗。

圖2 夾帶劑濃度對萃取色素的影響

2.3 溫度對萃取色素的影響

夾帶劑溫度變化導致二氧化碳的密度變化，可影響萃取流體的極性，為了避免萃取溫度過高導致發生反應而影響萃取色素質量和抗氧化活性，選擇25～45℃范圍進行對比試驗。乙醇夾帶劑∶色素按質量比為3∶2的比例混合3份，分別移至萃取釜，具體的萃取實驗條件為：萃取溫度分別為25、35、45℃，萃取壓力為20 MPa，萃取時間為60 min，二氧化碳流速設為20 L/h。實驗結果見圖3所示。由圖3中數據可知，萃取溫度分別是25、35、45℃時，萃取色素的色率為40700、40400、43600 EBC單位，萃取色素的紅色指數為1.62、1.70、1.89。在實驗溫度范圍內，萃取色素產品的色率及紅色指數，隨著溫度的升高而升高。表明萃取溫度增加，則被萃取溶質的揮發性能力和擴散系數也會增加。因此選取最優萃取溫度為45℃。

圖3 萃取溫度對萃取色素的影響

2.4 萃取壓力對萃取色素的影響

乙醇夾帶劑∶色素按質量比為 3∶2的比例混合4份，分別移至萃取釜，具體的萃取實驗條件為：萃取溫度為45℃，萃取壓力分別為15、20、25、30、35 MPa，萃取時間為60 min，二氧化碳流速設為20 L/h。實驗結果見圖4所示：根據圖4可知，在萃取壓力為15～30 MPa范圍時，隨萃取壓力的增加，萃取產品的色率和紅色指數隨之增加：萃取壓力為15 MPa時取得最小值，色率為34300 BEC單位、紅色指數為1.85；萃取壓力位30 MPa時達到最大值，色率為44760 EBC單位、紅色指數為2.02。這是由于在一定壓力范圍內，萃取壓力越大，萃取流體二氧化碳的密度越大，被萃取物的溶解度越大。而當萃取壓力位35 MPa時，萃取產品的色率和紅色指數顯著下降，色率降至 14500 EBC單位、紅色指數為1.08。

另外，根據圖5，DPPH自由基清除率先升后降，在30 MPa左右達到最大值，壓力高于30 MPa后，DPPH自由基清除率有所下降。在一定的壓力范圍內，壓力的增大，使超臨界二氧化碳流體的密度增大，利于色素成分的提取，但是，超臨界二氧化碳流體的擴散系數隨壓力的增大而減小，不利于活性色素成分的提取。考慮成本等各方綜合因素，選擇萃取壓力為25 MPa。

圖4 萃取壓力對萃取色素的影響

圖5 萃取壓力對色素DPPH值的影響

2.5 萃取時間對萃取色素的影響

乙醇夾帶劑∶色素按質量比為 3∶2的比例混合4份，分別移至萃取釜，具體的萃取實驗條件為：萃取溫度為45℃，萃取壓力為25MPa，萃取時間分別為30、60、90、120、150 min，二氧化碳流速設為20 L/h。實驗結果見圖6所示。由圖6中數據可知，萃取時間分別為30、60、90、120、150 min時，萃取色素的色率為21000、44100、47000、48100、48900 EBC單位，萃取色素的紅色指數為2.48、2.01、1.96、1.93、1.82。可以看出：隨著萃取時間的延長，色素色率在前期增長速率很快，但當萃取時間大于90 min時，糖蜜色素的色率變化速率趨于平緩；另外，萃取產品的紅色指數，隨著萃取時間的增加而降低。綜上所述，為節約能源以及流體成本，選用最優的萃取時間是90 min。

2.6 二氧化碳流速對萃取色素的影響

圖6 萃取時間對糖蜜色素的影響

乙醇夾帶劑∶色素按質量比為 3∶2的比例混合4份，分別移至萃取釜，具體的萃取實驗條件為：萃取溫度為45℃，萃取壓力為25 MPa，萃取時間分別為90 min，二氧化碳流速分別為15、20、25、30 L/h。實驗結果見圖7所示。由圖7中數據可知，二氧化碳流速分別為15、20、25、30、35 L/h時，萃取色素的色率為 29800、46900、49760、50100、50250 EBC單位，萃取色素的紅色指數為2.07、1.97、1.83、1.62、1.32。結果表明：二氧化碳流速范圍為 15～25 L/h時，產品色率的增加速率較快，而當二氧化碳流速高于25 L/h時，萃取產品的色率變化不明顯，推測是因為萃取已接近終點，增加二氧化碳的流速對增加被萃取物萃取效果不顯著；萃取色素的紅色指數隨著二氧化碳流速的增加而降低。

另外，由圖8可知，在二氧化碳流速為15～25 L/h時，DPPH自由基清除率較快速的升高；在二氧化碳流速為25～35 L/h時，色素類化合物的活性基本保持穩定。考慮設備維護成本等因素，選取二氧化碳流速的最優水平為25 L/h。

綜上所述，根據單因素實驗結果得最佳工藝條件為：乙醇夾帶劑質量濃度60%、萃取溫度為45℃、萃取壓力為25 MPa、萃取時間為90 min以及二氧化碳流量25 L/h，此條件下，超臨界二氧化碳萃取甘蔗糖蜜中的色素總量為2.83%、色率為49570 EBC單位、紅色指數為1.85，此色素對DPPH自由基清除率為76.2%。

圖7 二氧化碳流速對糖蜜色素的影響

圖8 二氧化碳流速對色素DPPH值的影響

3 結論

通過單因素實驗，選擇確定夾帶劑種類、夾帶劑用量、萃取溫度、萃取壓力、萃取時間以及二氧化碳流量等因素的最優取值范圍。根據實驗結果得最佳工藝條件為：乙醇夾帶劑質量濃度60%、萃取溫度為45℃、萃取壓力為25 MPa、萃取時間為90 min以及二氧化碳流量 25 L/h，此條件下試驗超臨界二氧化碳萃取甘蔗糖蜜中的色素總量為 2.83%、色率為49570 EBC單位、紅色指數為1.85，此色素對DPPH自由基清除率為76.2%。超臨界二氧化碳萃取技術是利用極性的差異將糖蜜中低極性色素成分萃取出來，結果表明：采用此方法能在低溫下高效提取糖蜜中油溶性色素，且能保護活性成分不受破壞，具有良好的抗氧化活性。研究結果可為資源化利用糖蜜中色素提供理論和技術依據。