甘薯花青素合成酶（ANS）基因的克隆及其組織表達模式分析

楊慧珍

（山西農業大學農學院，山西太原030031）

甘薯（Ipomoea batatas）又稱白薯、紅薯、地瓜、番薯等，屬旋花科番薯屬植物，其塊莖富含淀粉，在世界主要糧食作物產量中排名第7 位；在我國則僅次于水稻、小麥和玉米，居第4 位[1]。花青素屬類黃酮化合物，作為一種很強的抗氧化劑，其具有調節機體免疫力、抗腫瘤、抗衰老、降血糖、增強記憶力以及抵抗病毒等醫療保健價值[2-4]。甘薯塊莖的顏色是由花青素及次生代謝產物的含量不同而決定的，表現為白色、黃色、橙色和紫色等多種顏色。在花青素代謝中，關鍵酶的基因及表達量起主導性作用，影響花青素積累的關鍵酶主要有F3H、DFR、ANS、GT 等[5-6]。

花青素合成酶（Anthocyanidin synthase，ANS）是生物合成花青素后期的關鍵酶，其作用是催化無色花青素脫水氧化后形成有色的花青素[7]。迄今為止，花青素合成酶基因已經從金蕎麥（Fagopyrum dibotrys）[8]、銀杏（Ginkgo biloba）[9]、擬南芥（Arabidopsis thaliana）[10]和芥菜（Brassica juncea（L.）Czernajew）[11]等植物中克隆得到。

本研究室前期對白心甘薯（徐薯18 號）和紫心甘薯（徐紫薯3 號）移栽后90 d 不同組織樣品進行轉錄組測序，獲得差異表達基因，結合NCBI 中甘薯ANS 基因序列，通過PCR 擴增獲得徐紫薯3 號的花青素合成酶基因IbANS，對其基因編碼序列進行生物信息學分析；并用real-time PCR 法分析該基因在不同甘薯品種及不同組織中的表達差異，旨在為紫心甘薯花青素形成的分子機制研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 紫心甘薯徐紫薯3 號和白心甘薯徐薯18 號于2018 年5 月種植于山西省農業科學院東陽試驗田，移栽后90 d，分別取塊根、莖和葉新鮮材料，裝入滅過菌的離心管中，立即加液氮，然后置于-80 ℃冰箱內保存。

1.1.2 儀器 瓊脂糖水平電泳儀（DYCP32A，北京），實時熒光定量 PCR 儀（ABI 7500Fast，美國）。

1.1.3 試劑 RNA 提取試劑Trizol Reagent、反轉錄試 劑 盒 Prime ScriptTMRT reagent Kit、pMD18-T 載體、實時熒光定量試劑盒SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ、pMD19-T，均購自中國Takara 公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購于北京天根生化科技有限公司；PCR引物合成、PCR 產物測序均由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 的提取和cDNA 的反轉錄 使用Trizol 法提取紫心甘薯徐紫薯3 號葉片的總RNA，按照反轉錄試劑盒Prime ScriptTMRT reagent Kit 說明書中的步驟合成cDNA，置于-20 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 甘薯ANS 基因cDNA 的獲得 利用NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）Gene 數據庫檢索甘薯ANS，然后在前期測序的甘薯轉錄組數據中BLAST搜素ANS 同源序列，利用Primer 5.0 設計特異引物（上游引物：5′-IbANS-PF AATGGTGACTACTATTA CTGTTCCG-3′下游引物：5′-IbANS-PR CAACCAT AATAATACCAAACGG-3′），以紫心甘薯葉片 cDNA為模板，PCR 產物跑膠檢測，割膠回收目標條帶，連接到pMD18-T 載體上，然后轉化大腸桿菌，挑取單克隆培養，菌液PCR 篩選后送上海生工生物工程公司進行測序。

1.2.3 生物信息學分析 用ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）對ANS 的一級結構及其理化性質進行分析；用SOPMA 預測ANS 蛋白的二級結構；用TMH MMServerv.2.0 預測ANS 蛋白質跨膜方向和跨膜區；用ProtScale 對ANS 的疏水性/親水性進行分析；用expasy 預測蛋白功能結構域；用Sigalp 對ANS 蛋白信號肽進行預測；用ProtComp預測蛋白的亞細胞定位；用SWISS-MODEL 對ANS蛋白三維結構圖建模；用DNAMAN 6.0 軟件對氨基酸序列進行同源性比對；使用MEGA 7.0 軟件用鄰接法構建系統進化樹。

1.2.4 實時熒光定量PCR 檢測 根據獲得的甘薯ANS 基因的核酸序列，利用Primer 5.0 在線軟件設計熒光定量引物（IbANS-real-F：5′-CCTCCAAGTC CTCCGAGTTGAT-3′；IbANS-real-R：5′- TACATA AGGCCGGAGGAAGAGC-3′）。以白心甘薯和紫心甘薯塊根、莖、葉的cDNA 為模板，選取IbARF 基因（F：5′- CTTTGCCAAGAAGGAGATGC-3′，R：5′-TC TTGTCCTGACCACCAACA-3′）作為內參基因，參照TaKaRa 公司的SYBRRPremix Ex TaqTMII 說明書，進行實時熒光定量分析。反應體系為：cDNA 模板1 μL，10 μmol/L PF/PR 0.4 μL，SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ5.0 μL，RNase free H2O3.2 μL。反應程序設置為：95 ℃預變性 30 s；95 ℃變性 10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸 20 s，共 40 個循環。每個樣品設有3 次重復，使用 2-ΔΔCT法計算出目的基因的表達量。

1.3 數據分析

數據處理和作圖采用Excel 軟件，組織間基因表達量采用SPSS v23 one-way ANOVA 法進行差異顯著性分析（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 甘薯IbANS 基因克隆與電泳檢測

用設計的基因特異引物進行PCR 擴增，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增出大小約1 200 bp的預期條帶（圖1）。

2.2 理化性質分析結果

經ProtParam 對甘薯的ANS 蛋白理化性質進行預測分析，結果表明，蛋白的分子質量為40531.27ku，分子式為C1813H2855N487O542S12，總原子數為5 709，氨基酸為362 個。在該基因編碼的氨基酸中，不含Sec（U）和Pyl（O），Trp（W）、Cys（C）的含量均為1.4%，含量最高的是Glu（E），占11.0%。總的帶正電殘基（Asp＋Glu）為 56、負電殘基（Arg＋Lys）為 43。等電點pI 為5.32，不穩定系數為43.33，屬不穩定蛋白質。脂肪指數為84.81，親水性評估分值為-0.141，因此，該蛋白預測為親水性蛋白質。

2.3 親/疏水性分析結果

通過ProtScale 軟件進行疏水性/親水性預測，結果如圖2 所示，表明ANS 蛋白為親水性蛋白，與2.1 理化性質分析結果一致。

2.4 蛋白跨膜結構域及保守結構域分析

經TM H M M 軟件預測蛋白質跨膜區和跨膜方向，結果顯示，沒有跨膜螺旋模型（概率均小于0.5），沒有明顯跨膜現象（圖3）。說明蛋白中沒有跨膜區。

利用expasy 預測蛋白功能結構域，結果如圖4所示，該基因編碼的蛋白具有典型的Fe2+- 依賴的雙加氧酶家族（2OG-FeII_Oxy）和2-O- 酮戊二酸的保守結構域，位于第212—311 個氨基酸。

2.5 蛋白信號肽預測

用Sigalp 4.1 對ANS 蛋白進行信號肽及切割位點預測，采用神經網絡（NN）算法。其中，Y-score 是綜合剪切位點的分值，S-score 是信號肽的分值，C-score 是原始剪切位點的分值。由圖5 可知，蛋白質中無信號肽存在的可能，屬于非分泌蛋白。

2.6 亞細胞定位預測

使用PSORT II 數據庫對ANS 蛋白進行亞細胞定位分析，結果表明，甘薯ANS 蛋白質定位在細胞質上的比率為45%，定位在微體（過氧化物酶體）上的比率為30%，定位在線粒體基質上的比率為10%，定位在葉綠體類囊體膜上的比率為10%。

2.7 蛋白質二級結構預測

利用SOPMA 軟件對ANS 蛋白進行二級結構的預測，結果如圖6 所示，甘薯ANS 蛋白的二級結構主要由 α- 螺旋（占35.36%）、β- 折疊（16.85%）、無規則卷曲（41.44%）和延伸鏈（6.35%）構成。其中，α- 螺旋和β- 折疊是維持蛋白質分子相對穩定性的重要結構，而在甘薯ANS 蛋白質中，α- 螺旋與β-折疊所占比例不高，且無規則卷曲很多，說明這種蛋白質的穩定性較弱，這與2.1 理化性質的分析結果一致。

2.8 蛋白質三級結構預測

利用SWISS-MODEL 對甘薯ANS 蛋白進行三維結構建模，結果表明（圖7），ANS 蛋白三維結構主要包括α- 螺旋和無規則卷曲，與2.6 二級結構預測結果相符。在模板結果頁面（Template Results）中，模型匹配到的最佳模板為2brt.1.A，相似度達到78.11%，可以該模板的三維結構作為參考。

2.9 系統進化樹分析

從NCBI 上搜索到其他物種的ANS 序列，使用DNAMAN 軟件進行氨基酸序列比對，結果如圖8所示，紫心甘薯ANS 蛋白同其他植物的ANS 蛋白具有較高的序列相似度，用DNAMAN 軟件計算其相似度為88.15%，且各ANS 蛋白序列中均具有Fe2+- 依賴的雙加氧酶家族（2OG-FeII_Oxy）的保守結構域，說明ANS 蛋白在不同植物間高度保守。

使用MEGA 7.0 軟件，構建甘薯和其他植物氨基酸序列進化樹如圖9 所示。結果表明，甘薯與三淺裂野牽牛（Ipomoea trifida）親緣關系最近，與同屬（Ipomoea）的植物聚為一簇，與陸地棉、黃牡丹、楓香的親緣關系較遠；系統發育進化樹逐級分支，具有較多層級，說明ANS 蛋白的進化兼具保守性和物種特異性。

2.10 實時熒光定量 PCR 檢測ANS 基因的組織表達結果

利用qRT-PCR 檢測IbANS 基因在紫心甘薯（徐紫薯3 號）和白心甘薯（徐薯18 號）的塊根、莖、葉組織中的表達水平，結果表明（圖10），IbANS 基因在紫心甘薯（徐紫薯3 號）中表達水平大小表現為根＞莖＞葉，在白心甘薯（徐薯18 號）中的表達水平大小表現為莖＞葉＞根；紫心甘薯（徐紫薯3 號）根、莖、葉中的ANS 表達水平顯著高于白心甘薯（徐薯 18 號）（P＜0.05）。

3 結論與討論

植物花青素的代謝和調控已成為當前科學研究的熱點，ANS基因在許多植物中已被克隆，并已證明其是花青素生物合成的重要結構基因。花青素合成酶是花色素苷合成末端的酶，影響花青素的累積，決定花色的形成及果實的著色[4]。ANS 是鐵離子和2-O- 酮戊二酸依賴的雙加氧酶家族，在保守結構域中的鐵離子和2-O- 酮戊二酸的結合位點是細胞色素P450 家族基因中存在的活性中心結構[8]。本研究通過序列比對結合PCR 技術從實驗室前期獲得的轉錄組數據庫中得到紫心甘薯徐紫薯3 號的ANS的全長cDNA 序列，對編碼的蛋白質生物信息學進行分析，結果表明，該基因編碼的蛋白具有典型的Fe2+- 依賴的雙加氧酶家族（2OG-FeII_Oxy）的保守結構域。系統進化分析顯示，甘薯與三淺裂野牽牛親緣關系最近，與陸地棉、黃牡丹、楓香的同源性較低，親緣關系較遠，基本符合植物分類學的進化規律。

ANS基因的表達具有組織特異性，如金蕎麥（Fagopyrum dibotrys）FdANS 在花期不同組織中的表達量大小表現為花＞葉＞莖＞根[8]；LIU 等[12]對甘薯（Ipomoea batatas）IbANS 的組織表達分析表明，IbANS 在所有組織中均有表達，但在塊根及周皮中表達量較高。本研究利用實時熒光定量PCR 技術檢測了紫心甘薯和白心甘薯不同組織中IbANS 的表達模式，結果發現，ANS基因的表達具有明顯的組織特異性，在白心甘薯莖、葉中的表達量高于塊根中，而在紫心甘薯塊根中的表達量高于莖和葉。相關研究表明，ANS表達具有品種特異性，表達水平為深色＞淺色＞白色/無色品種，如水母雪蓮花（Saussurea medusa）中，ANS 在紅色系愈傷組織中的表達量高于白色系和綠色系[13]；紫甘藍（Brassica oleracea var. capitata）ANS的表達水平明顯高于青甘藍[14]。本研究中，紫心甘薯塊根、莖、葉中的ANS表達水平顯著高于白心甘薯（P＜0.05），尤其在塊根中的相對表達量是白心甘薯的37 倍，證實顏色較深的組織部位ANS基因的表達量較高，說明ANS可能參與紫心甘薯塊根中花青素的積累。

ANS 是影響花青素合成的關鍵酶，在作物育種中，通過上調ANS 基因的表達，提高花青素的含量，培育花青素含量豐富的植物品種。REDDY 等[15]在水稻育種中通過過量表達ANS基因，增加轉基因植株中花青素的含量，使水稻的種皮呈現紫紅色。本研究結果進一步闡明IbANS 基因在紫心甘薯塊根中的形成及累積機制，最終為培育富含花青素的甘薯新品種奠定一定的理論基礎。