紅肉蘋果果實酚類物質含量及抗氧化性測定

吳 乾 ，王艷芳 ，蔚沐庭 ，趙惠英 ，楊廷楨 ，王 騫 ，張小軍 ，高 燕 ，郝燕燕

（1.山西農(nóng)業(yè)大學園藝學院，山西太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學果樹研究所，山西太谷030800）

蘋果（Malus domestica Mill）.是薔薇科（Rosaceae）蘋果屬（Malus）植物，屬于落葉喬木，在我國已經(jīng)有2 000 多年的栽培歷史[1]。蘋果酸甜清香，不僅含有蛋白質、糖類、有機酸、維生素和微量元素等，還含有多酚、類黃酮等功能性物質。其中，酚酸、黃酮類物質及花青素等是蘋果中主要的酚類物質[2]。對藍靛果[3]、獼猴桃[4]、杏[5]、藍莓[6]的研究表明，酚類物質具有強的抗氧化功能，有益人類健康[7]。

“醫(yī)食同源”是目前果業(yè)的發(fā)展方向，“吃營養(yǎng)，吃健康”已經(jīng)成為人們的共識[8]。紅肉蘋果（Malus pumila Mill.）是新疆野蘋果的一個變種，原產(chǎn)我國新疆伊犁地區(qū)以及中亞的哈薩克斯坦等地[9]，具有酚類物質含量高的特點。因此，有效利用新疆野蘋果等種質資源，開展遠緣雜交育種，進一步培育高類黃酮（紅肉與紅皮）蘋果，對于推動我國蘋果產(chǎn)業(yè)的優(yōu)質高效發(fā)展及“健康中國”均具有重要意義[10]。

本研究以紅肉蘋果紅滿堂、紅色之愛（Red Love）成熟果實為試材，以紅富士為對照，測定3 個品種的總酚、總黃酮、總花青素含量以及抗氧化性，并對酚類物質含量與抗氧化性進行相關性分析，旨在篩選出高類黃酮、高抗氧化品種。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗所用蘋果品種（圖1）為紅肉品種紅滿堂、紅色之愛（Red Love），以白肉品種紅富士為對照，均采摘成熟期果實。

1.2 試驗方法

每個蘋果品種選取5 株長勢基本一致、生長發(fā)育良好的樹，在樹冠外圍隨機采取果實20 個。單株小區(qū)，5 次重復。果實通過清洗、擦干，取薄厚一致的果皮（約1.0 mm）及去核果肉，用液氮速凍后冷凍研磨儀粉碎成細粉，稱質量分裝，存放于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1 酚類物質的提取 參照汪曉謙[11]的方法提取。以70%甲醇內含2%甲酸的混合溶液為提取液。提取時，稱取果皮或果肉0.1 g，在0 ℃下加1 mL 提取液研磨之后再加1 mL 提取液沖洗研缽，將2 次加入的提取液并入離心管。將離心管于25 ℃、1 000 r/min 條件下振蕩30 min，之后在 10 000 g 下離心10 min，取上清液待用。

1.2.2 總酚含量的測定 總酚含量的測定采用Folin-Ciocalteu 法[12]。在離心管中依次加入 20 μL 果實提取液、1.58 mL 蒸餾水、0.1 mL Folin-Ciocalteu試劑（1∶1 稀釋），搖勻，充分反應 1 min 后加入飽和Na2CO3溶液1.5 mL，避光反應2 h。以提取溶劑為對照，用分光光度計在765 nm 波長下測定吸光度，結果以沒食子酸當量（GAE）表示，單位為mg/g。

1.2.3 總黃酮含量的測定 總黃酮含量的測定采用亞硝酸鈉- 硝酸鋁法[13]。在離心管中依次加入0.5 mL 果實提取液、0.15 mL 5%NaNO2溶液，靜置6 min 后加入0.15 mL10%A（lNO）33溶液，靜置6 min后加入2 mL 4%NaOH 溶液，最后加入2.2 mL 蒸餾水，振蕩混勻靜置3 min 后于508 nm 下測定吸光度，結果以蘆丁當量（RE）表示，單位為mg/g。

1.2.4 總花青素含量的測定 總花青素含量的測定采用pH 示差法。取果實提取液2 mL 至10 mL試管中，分別用 pH＝1.0（0.2 mol/L KCl∶0.2 mol/L HCl＝25∶67，V/V）、pH＝4.5（醋酸 - 醋酸鈉緩沖液：取18 g 醋酸鈉，加冰醋酸9.8 mL，再加水稀釋至1 000 mL）的緩沖液定容，反應30 min，用紫外分光光度計在510、700 nm 處測定吸光度，以矢車菊-3-葡萄糖苷表示，利用公式進行花青素含量測定，單位為mg/kg。

式中，A 為待測液花青素總吸光度；ΔApH1為pH值為1 條件下的吸光度差值；ΔApH4.5為pH 值為4.5條件下的吸光度差值；A510為待測液花青素在510 nm處的吸光度；A700為待測液花青素在700 nm 處的吸光度；c 為待測液花青素質量分數(shù)；V 為提取液總體積（mL）；DF 為稀釋倍數(shù)；M 為矢車菊 -3- 葡萄糖苷的摩爾質量（449.2 g/mol）；ε 為矢車菊 -3- 葡萄糖苷的消光系數(shù)（29 600 L（/mol·cm））；m 為樣品質量（g）；L 為光程（1 cm）。

1.2.5 DPPH 法測定抗氧化性 DPPH 法測定抗氧化活性參照ZHANG 等[14]的方法。用無水乙醇溶解DPPH，使溶液的物質的量濃度達到0.1 mmol/L，配制完成后置于包裹錫箔紙的燒瓶中，4 ℃暗保存。測定時取0.1 mL 待測樣品，加入4 mL 0.1 mmol/L DPPH 溶液，充分振蕩 30 s，暗反應 30 min 之后，于517 nm 處測定吸光度。

繪制抗壞血酸的自由基清除率相對于其濃度的標準曲線。DPPH 抗氧化活性單位為mg/100 g。

1.2.6 FRAP 法測定抗氧化性 FRAP 法測定抗氧化活性參照ZHANG 等[14]的方法。FRAP 儲備液由300 mmol/L 乙酸鈉緩沖液（3.1 g C2H3NaO2·3H2O＋16 mL C2H4O2，pH＝3.6）、10 mmol/L TPTZ 溶液（溶于40 mmol/L HCl） 以及 20 mmol/L FeCl3·6H2O 這 3 種溶液按照10∶1∶1 的體積比混合而成，現(xiàn)用現(xiàn)配。測定時，取20 μL 果實提取液加入1 mL 水與2 mL FRAP 儲備液，充分混合，于37 ℃反應10 min 后，在593 nm 處測定吸光度。

繪制以水溶性維生素E（Trolox）為標樣的標準曲線。樣品的FRAP 抗氧化活性單位為mg/100 g。

1.2.7 ABTS 法測定抗氧化性 ABTS 法測定抗氧化活性參照AMIR 等[15]的方法，略有改動。ABTS·+儲備液由5 mL7 mmol/LABTS 溶液和5 mL2.45 mmol/L K2S2O8溶液混合之后，于室溫暗反應12 h 后制成。測定時用乙醇稀釋ABTS+·儲備液，于734 nm 處測得0.70±0.02 的吸光度。之后將50 μL 果實提取液與4 mL 乙醇稀釋后的ABTS+·儲備液混合，避光反應6 min 后于734 nm 處測定吸光度。樣品的ABTS抗氧化性單位為mg/100 g。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗結果以平均值±標準差表示。使用Origin 2018 制圖，運用SAS 8.1 軟件對所得數(shù)據(jù)進行顯著性差異分析，運用SPSS 21 軟件中Pearson 函數(shù)對總酚含量、總黃酮含量、總花青素含量與以DPPH法、FRAP 法、ABTS 法測定的抗氧化性之間的相關性進行計算。

2 結果與分析

2.1 紅肉蘋果果實酚類物質含量分析

由圖2-A 可知，紅滿堂果皮總酚含量最高，為9 899.99 mg/kg，極顯著高于紅色之愛（8 474.12 mg/kg）和紅富士（7 563.81 mg/kg）；紅滿堂果肉總酚含量最高，為4 124.74 mg/kg，極顯著高于紅色之愛（3 614.01 mg/kg）和紅富士（2 627.64 mg/kg）。

從圖2-B 可以看出，紅滿堂果皮總黃酮含量最高，為39 459.77 mg/kg，極顯著高于紅色之愛（25 546.51 mg/kg）和紅富士（21 022.64 mg/kg）；紅滿堂果肉總黃酮含量最高，為15 455.34 mg/kg，極顯著高于紅色之愛（11 486.47 mg/kg）和紅富士（7 697.58 mg/kg）。

從圖2-C 可以看出，紅滿堂果皮總花青素含量最高，為499.68 mg/kg，極顯著高于紅色之愛（271.19 mg/kg）和紅富士（201.67 mg/kg）；紅滿堂果肉總花青素含量最高，為135.37 mg/kg，極顯著高于紅色之愛（58.88 mg/kg）和紅富士（35.98 mg/kg）。

3 個品種總酚、總黃酮、總花青素含量均表現(xiàn)為果皮顯著高于果肉。

2.2 紅肉蘋果果實抗氧化性分析

由圖3-A 可知，紅滿堂果皮DPPH 自由基清除能力最強（510.47 mg/100 g），極顯著高于紅色之愛（318.51 mg/100 g）和紅富士（170.59 mg/100 g）；紅滿堂果肉DPPH 自由基清除能力最強（439.04mg/100g），極顯著高于紅色之愛（248.37 mg/100 g）和紅富士（71.94 mg/100 g）。

由圖3-B 可知，紅滿堂果皮FRAP 抗氧化能力最強，為381.39 mg/100 g，極顯著高于紅色之愛（303.60 mg/100 g）和紅富士（108.80 mg/100 g）；紅滿堂果肉FRAP 抗氧化能力最強，為238.51 mg/100 g，極顯著高于紅色之愛（89.55 mg/100 g）和紅富士（52.65 mg/100 g）。

由圖3-C 可知，紅滿堂果皮ABTS+·自由基清除能力最強，為581.61 mg/100 g，極顯著高于紅色之愛（515.33 mg/100 g）和紅富士（214.12 mg/100 g）；紅滿堂果肉ABTS+·自由基清除能力最強，為365.29mg/100g，極顯著高于紅色之愛（244.51 mg/100 g）和紅富士（143.82 mg/100 g）。

3 個品種DPPH 自由基清除能力、FRAP 抗氧化能力、ABTS·+自由基清除能力都表現(xiàn)為果皮顯著高于果肉。

2.3 果實酚類物質含量與抗氧化性的相關性分析

對果實酚類物質（總酚、總黃酮、總花青素）含量與抗氧化性（DPPH 自由基清除能力、FRAP 抗氧化能力及ABTS+·自由基清除能力）進行相關性分析，結果如圖4 所示，果皮中總酚、總黃酮和總花青素含量都與DPPH 自由基清除能力呈極顯著正相關；果皮中總酚與FRAP 抗氧化能力呈顯著正相關，總黃酮、總花青素與FRAP 抗氧化能力不存在顯著相關性；果皮中總酚含量與ABTS+·自由基清除能力呈極顯著正相關，總黃酮、總花青素與ABTS+·自由基清除能力呈顯著正相關。

果肉中總酚、總黃酮、總花青素含量與3 個抗氧化指標均呈極顯著正相關。

3 結論與討論

HU 等[16]對蘋果果實酚類物質研究表明，蘋果屬植物在不同組織中，其含量具有顯著差異。HOLDERBAUM等[7]對蘋果酚類物質分布的研究發(fā)現(xiàn)，蘋果果皮中總酚含量大于果肉中含量。本研究結果表明，紅肉蘋果紅滿堂果實中酚類物質含量極顯著高于紅色之愛和紅富士，且3 個品種果皮中酚類物質含量均顯著高于果肉中含量，這一結果與前人研究結論一致。

本試驗對蘋果果實DPPH 自由基清除能力、FRAP 抗氧化（鐵離子還原）能力以及ABTS+·自由基清除能力進行分析，結果表明，紅肉蘋果紅滿堂、紅色之愛果實的DPPH 自由基、ABTS+·自由基清除能力、FRAP 抗氧化能力極顯著高于紅富士，且紅滿堂極顯著高于紅色之愛。前人研究的結果表明，蘋果抗氧化性與蘋果酚類物質組成及含量密切相關，酚類物質越豐富，蘋果的抗氧化性越強[17]。本研究通過對果實酚類物質（總酚、總黃酮、總花青素）含量與抗氧化性（DPPH 自由基清除能力、FRAP 抗氧化能力及ABTS+·自由基清除能力）進行相關性分析的結果也支持了此結果。紅滿堂果實高的酚類物質含量及其高的抗氧化性，說明紅滿堂可作為加工型高酚類品種進行開發(fā)利用。紅滿堂是以舞美、山定子為親本雜交選育出的新型紅肉品種，其果實自幼果期直至成熟期均為紫紅色，果汁呈血紅色[18]，果肉不易褐變，可做天然藥妝品。本研究進一步為紅滿堂的開發(fā)利用提供了理論支撐。