超重力處理對(duì)平邑甜茶生理特性的影響

王麗文，段國鋒

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西太谷030801）

近年來，航天事業(yè)和生物育種技術(shù)的飛速發(fā)展引領(lǐng)了太空誘變育種的潮流[1]。太空育種是指利用重力、磁場(chǎng)等特殊的太空環(huán)境誘變作用，使生物或植物基因產(chǎn)生變異，以此創(chuàng)造出罕見的突變材料，對(duì)于開展突破性新品種的選育有著至關(guān)重要的作用，在很多領(lǐng)域如能源、植物、環(huán)境、生物化工等方面發(fā)揮了巨大的作用，是一種有效的誘變育種新技術(shù)[2]。目前，很多研究表明，通過改變超重力處理的時(shí)間以及重力加速度等能夠影響植物幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育。段國鋒等[3]通過超重力處理黑大豆幼苗的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過處理后的幼苗葉綠素含量、過氧化物酶（POD）活性以及超氧化物歧化酶（SOD）活性均高于未經(jīng)處理的黑大豆幼苗。SOGA 等[4-5]通過超重力對(duì)玉米和紅豆的研究發(fā)現(xiàn)，超重力對(duì)植物幼苗的影響主要是抑制幼苗胚軸的延長(zhǎng)。KITTANG 等[6]通過超重力處理8 000 個(gè)擬南芥基因，發(fā)現(xiàn)有177 個(gè)基因出現(xiàn)了變化。郭小建等[7]研究發(fā)現(xiàn)，通過降低重力加速度以及時(shí)間可以增強(qiáng)綠豆幼苗的過氧化氫酶和過氧化物酶活性。這些研究表明，經(jīng)過超重力處理可能會(huì)對(duì)植物種子的萌發(fā)及其生理生化特性產(chǎn)生影響。

平邑甜茶屬于湖北海棠類，具有較強(qiáng)的抗寒性和抗?jié)承裕蜐衲望}，對(duì)蘋果根腐病、白粉病、白絹病、褐斑病及蘋果綿蚜具有天然抗性[8]，具有非常強(qiáng)的無融合生殖能力，是優(yōu)異的蘋果種質(zhì)資源。目前，蘋果的再植障礙問題會(huì)使蘋果樹出現(xiàn)生長(zhǎng)發(fā)育不良的現(xiàn)象，從而造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[9-11]。

為研究蘋果種子的抗逆性，從而提高種質(zhì)，本試驗(yàn)通過改變超重力和作用時(shí)間來研究超重力技術(shù)對(duì)平邑甜茶種子萌發(fā)以及生理特性的影響，為今后超重力在植物育種以及抗逆栽培方面的研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試平邑甜茶種子由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。

1.2 方法

1.2.1 種子處理 取干凈飽滿且經(jīng)過低溫層積的平邑甜茶種子，用98 ℃的熱水燙種3～5 s 對(duì)其進(jìn)行消毒處理，為了避免燙傷種子，在消毒期間要不斷攪拌，之后迅速轉(zhuǎn)入到冷水中，浸泡6 h。控水晾干后，采用 5 000、10 000、15 000 r/min 的超重力分別對(duì)種子進(jìn)行1、3、5 h 高速離心處理，以無超重力處理為對(duì)照，每組處理設(shè)置3 次重復(fù)。將處理好的平邑甜茶種子置于內(nèi)鋪雙層濾紙的直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中，加入適量蒸餾水置于（25 ± 1）℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培育，每隔24 h 更換蒸餾水和濾紙。

1.2.2 種子發(fā)芽率的測(cè)定 每天在同一時(shí)間記錄種子的發(fā)芽數(shù)（芽長(zhǎng)為種子長(zhǎng)度1/2 為準(zhǔn)），計(jì)算發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)及發(fā)芽指數(shù)。

式中，Gt 為t 時(shí)間內(nèi)的發(fā)芽數(shù)；Dt 為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)。

1.2.3 幼苗形態(tài)指標(biāo)測(cè)定 發(fā)芽結(jié)束后，每處理隨機(jī)取幼苗5 株，將樣品按照清水→洗滌劑→清水→1%鹽酸→3 次去離子水的順序進(jìn)行沖洗并用濾紙吸干，之后迅速稱質(zhì)量記錄并取其平均值作為鮮質(zhì)量，然后測(cè)量根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)，隨后在80 ℃下烘干至恒質(zhì)量，取平均值即為干質(zhì)量[12]。

1.2.4 幼苗抗氧化酶活性的測(cè)定 待幼苗長(zhǎng)出第3片真葉時(shí)，移栽到育苗盤中，隨機(jī)摘取不同部位的葉片進(jìn)行生理指標(biāo)的測(cè)定。葉綠素含量的測(cè)定采用分光光度法，過氧化物酶（POD）活性、過氧化氫酶（CAT）活性和超氧化物歧化酶（SOD）活性分別采用愈創(chuàng)木酚法、紫外吸收法和NBT 光還原抑制法進(jìn)行測(cè)定[13]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SAS 統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與統(tǒng)計(jì)，所得數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 超重力處理對(duì)平邑甜茶種子萌發(fā)的影響

由表1 可知，超重力處理后，平邑甜茶種子的各發(fā)芽指標(biāo)（發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)以及發(fā)芽指數(shù)）呈現(xiàn)不同程度的變化。平邑甜茶在中速（10 000 r/min）的超重力下，在3 h 處理時(shí)各發(fā)芽指標(biāo)均大于對(duì)照，達(dá)到最大值；在低、高速（5 000、15 000 r/min）的超重力處理下，發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)以及發(fā)芽指數(shù)均隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。高速超重力處理下，發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)以及發(fā)芽指數(shù)均明顯降低，推測(cè)可能是由于過度的超重力影響了平邑甜茶種子的發(fā)芽機(jī)制，損傷了種子內(nèi)部結(jié)構(gòu)[14]。在種子萌發(fā)的過程中，培養(yǎng)到第15 天時(shí)，種子萌發(fā)相對(duì)較多（作為高峰期階段），在10 000 r/min 的超重力處理3 h 下，發(fā)芽勢(shì)最大。總體來看，發(fā)芽指標(biāo)隨著超重力的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。

表1 不同超重力處理對(duì)平邑甜茶種子發(fā)芽指標(biāo)的影響

2.2 超重力處理對(duì)平邑甜茶幼苗形態(tài)的影響

從表2 可以看出，與對(duì)照相比，經(jīng)超重力處理后，平邑甜茶幼苗的株高、根長(zhǎng)、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量均有不同程度的降低。隨著處理重力加大，幼苗各項(xiàng)指標(biāo)不斷降低，其中，株高（降幅為0.07%～0.21%）和根長(zhǎng)（降幅為0.04%～0.13%）差異明顯；相同重力處理下，隨著超重力處理時(shí)間延長(zhǎng)，各項(xiàng)指標(biāo)也在不斷減小。表明，超重力處理對(duì)平邑甜茶幼苗的生長(zhǎng)有抑制作用。

表2 不同超重力處理對(duì)平邑甜茶幼苗形態(tài)的影響

2.3 超重力處理對(duì)平邑甜茶幼苗葉綠素含量的影響

作為光能的吸收器，葉綠素含量的高低與植株體內(nèi)有機(jī)物的生成量息息相關(guān)[15]。葉綠素在植物光合作用過程中充當(dāng)光能的“吸收者”和“傳遞者”，少數(shù)葉綠素a 可以將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能，釋放氧氣，給植物自身以及人類活動(dòng)提供所需能量。通常來說，植物中所含葉綠素越多，能夠通過光能進(jìn)行合成生產(chǎn)的有機(jī)物質(zhì)也就越多。由表3 可知，平邑甜茶種子經(jīng)超重力處理后，葉綠素a、葉綠素b 以及葉綠素含量均顯著高于對(duì)照。隨著超重力增加，葉綠素含量增加，15 000 r/min 處理5 h 的葉綠素含量最高，與對(duì)照間差異均達(dá)顯著水平。這與段國鋒等[3]在大白菜中發(fā)現(xiàn)“超重力可以促進(jìn)葉綠素的合成”的結(jié)論一致。平邑甜茶葉片在低速（5 000 r/min）的超重力處理下，葉綠素a、葉綠素b 以及葉綠素的含量均隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，而在中高速（10 000、15 000 r/min）的超重力下，各葉綠素含量均表現(xiàn)出隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)而增加。當(dāng)超重力轉(zhuǎn)速一定時(shí)，差異不顯著，即處理時(shí)間對(duì)葉綠素含量的影響并不顯著。葉綠素a/b 值是在5 000 r/min 處理3 h 最大。表明，15 000 r/min 處理5 h 有利于平邑甜茶葉綠素含量的提高。

表3 不同超重力處理對(duì)平邑甜茶葉片葉綠素含量的影響

2.4 超重力處理對(duì)平邑甜茶幼苗抗氧化酶活性的影響

過氧化物酶（POD）既與植物的形態(tài)發(fā)生和建成有關(guān)，又與植物的抗逆性有關(guān)，是重要的植物保護(hù)酶之一[16]。超氧化物歧化酶（SOD）可以清除生物體內(nèi)多余的氧自由基，在機(jī)體代謝過程中減緩過多的氧自由基給機(jī)體帶來的危害[17]。過氧化氫酶（CAT）作為生物防御系統(tǒng)的一種關(guān)鍵酶，可清除由于植物體內(nèi)活性氧代謝增強(qiáng)而導(dǎo)致過度積累的過氧化氫（H2O2），以保護(hù)細(xì)胞正常生活，其活性可有效抵抗植物衰老[18-19]。影響抗氧化酶活性的因素有很多，伍鈞等[20]研究發(fā)現(xiàn)，Pb 脅迫下氮素形態(tài)及施氮量對(duì)酶活性的影響效果顯著；張冠初等[21]在干旱和鹽脅迫的條件下研究了花生抗氧化酶活性的變化。本試驗(yàn)則研究了超重力處理對(duì)平邑甜茶抗氧化酶活性的影響，結(jié)果如表4 所示。

表4 不同超重力處理對(duì)平邑甜茶幼苗抗氧化酶活性的影響

從表4 可以看出，與對(duì)照相比，經(jīng)超重力條件處理后POD 活性均明顯提高，其中，10 000 r/min 處理1 h 后的POD 活性最高。處理相同時(shí)間時(shí)，POD活性隨著超重力的增大呈先增加后降低，超重力轉(zhuǎn)速一定時(shí)差異不顯著。處理組的SOD 活性顯著低于對(duì)照，10 000 r/min 處理 5 h 的 SOD 活性最低。在低速（5 000 r/min）的超重力處理下，SOD 的活性隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增高，而在中高速（10 000、15 000 r/min）的超重力下，SOD 活性均隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。在一定的處理時(shí)間下，SOD 活性隨著重力的增大呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢(shì)。處理組的CAT 活性與對(duì)照相比，有增強(qiáng)也有降低，10 000 r/min處理3 h 的CAT活性增強(qiáng)最明顯，而在15 000 r/min條件下處理5 h 后活性最低。以上結(jié)果說明，只有在適當(dāng)?shù)某亓l件下處理適當(dāng)時(shí)間才可以提高POD、CAT 活性，而SOD 活性經(jīng)超重力處理后反而有失活的現(xiàn)象。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)測(cè)定了平邑甜茶種子在經(jīng)過不同超重力處理后的萌芽情況，結(jié)果表明，平邑甜茶種子經(jīng)超重力處理后，發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)以及發(fā)芽指數(shù)隨著超重力的增加呈現(xiàn)先增加后降降的趨勢(shì)，在10 000 r/min處理3 h 時(shí)各發(fā)芽指標(biāo)值最大。平邑甜茶種子在未經(jīng)超重力處理時(shí)，其萌發(fā)率極低，并且在超重力處理后，與對(duì)照組無顯著差異，與段智英等[22]在番茄中研究發(fā)現(xiàn)的“超重力使其發(fā)芽指標(biāo)降低”的結(jié)論不符合，猜測(cè)可能是由于平邑甜茶種子本身萌發(fā)率低，因此，抑制作用不明顯，再加上試驗(yàn)樣本較少，偶然性較大。

經(jīng)過對(duì)幼苗形態(tài)的研究發(fā)現(xiàn)，隨著超重力的加大（處理時(shí)間相同），平邑甜茶幼苗的株高、根長(zhǎng)、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量與對(duì)照相比均出現(xiàn)了不同程度的降低，其中，株高和根長(zhǎng)降幅差異明顯，在相同超重力條件下，隨著處理時(shí)間的增加，各項(xiàng)指標(biāo)也在不斷減小。研究結(jié)果表明，超重力處理對(duì)平邑甜茶幼苗的生長(zhǎng)有明顯抑制作用。

萌發(fā)的平邑甜茶幼苗葉片中葉綠素a、葉綠素b以及葉綠素含量經(jīng)過超重力處理后均顯著高于對(duì)照。隨著超重力增強(qiáng)，平邑甜茶幼苗的葉綠素含量也隨之增加，在15 000 r/min 的超重力處理5 h 時(shí)，葉綠素各含量達(dá)到最大，與對(duì)照組相比，每克葉片中的葉綠素含量增加了2.815 mg。因此，只有在適當(dāng)超重力處理?xiàng)l件（15 000 r/min、5 h）才能對(duì)平邑甜茶幼苗的葉綠素合成有利，能夠促進(jìn)有機(jī)物的生成，并且能夠進(jìn)一步提高平邑甜茶的抗逆栽培能力。

平邑甜茶葉片的POD、CAT 活性都高于對(duì)照，與前人的研究結(jié)果相同，在10 000 r/min 超重力下處理 1 h 時(shí)，POD 活性達(dá)到最大值，10 000 r/min 處理3 h 的CAT 活性增強(qiáng)最明顯，說明適當(dāng)?shù)某亓μ幚砜梢愿玫靥岣咧参镌谀婢持械纳婺芰Γ?duì)植物光合速率和呼吸速率有一定的影響。SOD 活性均低于對(duì)照，在低速超重力處理下，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增高，而在中高速超重力下，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，在一定的處理時(shí)間下，SOD 活性隨著超重力的增大呈先降低后增加。而楊凈等[23]在研究超重力處理對(duì)谷子種子影響的過程中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)超重力處理的2 種谷子的SOD 活性均高于對(duì)照組，并且差異顯著，此結(jié)論與本試驗(yàn)不相符，有可能是因?yàn)樵摮亓Ψ秶贿m合SOD 生存，可以嘗試改變超重力設(shè)置的梯度，從而提高SOD 活性。

本研究結(jié)果表明，超重力技術(shù)能夠影響平邑甜茶種子發(fā)芽指標(biāo)、葉綠素含量、幼苗形態(tài)以及生理特性，因此，通過離心處理來模擬超重力這種極端的環(huán)境是可行的，有希望為植物育種以及抗逆方面的探索提供一定的理論支持。