嗜熱鏈球菌富硒及抗氧化性研究

景晨茜，馬 玲

（山西農業大學食品科學與工程學院，山西太谷030801）

硒是人體所必需的微量元素之一，在自然環境中以無機硒和有機硒的形式存在，其中，無機硒主要為單質硒、硒化物、亞硒酸鹽等，有機硒主要為硒代半胱氨酸、硒代胱氨酸、硒代蛋氨酸、二甲基硒等[1]。大多數無機硒的毒性比有機硒大，難以被機體所吸收利用，而有機硒及單質硒的吸收利用率較高[2-3]。硒作為生物體內酶的活性組分，參與清除自由基和過氧化物，具有抗氧化性；還可增強機體免疫力，能拮抗多種有毒重金屬元素和一些物質[4]。缺硒易患克山病和大骨節??；但機體攝入過量的硒則會引起硒中毒，出現脫發、脫甲等。

中國營養學會推薦人體對硒的攝入量為55～400 μg/d，但在普通食物中的硒含量較低，無法滿足人體所需，可通過硒的生物轉化得到利用率較高的含硒物質。硒轉化載體中的微生物具有繁殖快、適應性強、代謝能力強等特點。有研究表明，乳酸菌可通過自身的理化作用，對絕大多數微量元素進行富集及有機態的轉化。1995 年，CALOMME 等[5]首次發現，乳酸菌對無機硒具有一定的富集作用。

本試驗通過研究一種嗜熱鏈球菌在富硒24 h后的酸度、菌落數、黏度的變化及抗氧化活性，旨在為進一步研發新的補硒制劑提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與培養基 供試菌種為唾液鏈球菌嗜熱亞種（Strptococcus salivarius）CH 9，由山西農業大學畜產品加工實驗室提供；供試脫脂乳培養基為10%脫脂乳，115 ℃滅菌15 min。

1.1.2 試劑 亞硒酸鈉，成都麥卡?；び邢薰?；磷酸二氫鉀，天津申泰化學試劑有限公司；過硫酸鉀、ABTS、DPPH，北京索萊寶科技有限公司；所有分析用有機試劑均為國產分析純；脫脂乳粉，恒天然集團安佳有限公司。

1.1.3 儀器與設備 FE28-Standard pH 計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；NDJ-1 指針式黏度計，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；7200 型可見分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種的活化及富硒條件的確定

1.2.1.1 菌種的活化 實驗室保存的嗜熱鏈球菌選用脫脂乳培養基，以接菌量3%、42 ℃培養24 h進行活化，連續活化3 代。

1.2.1.2 亞硒酸鈉濃度的確定 將已滅菌的脫脂乳培養基加入已滅菌的亞硒酸鈉溶液，配制培養基中的亞硒酸鈉質量濃度為 0、1、2、3、4、5、6、7、8 μg/mL，以接菌量為3%、在42 ℃下培養24 h，觀察培養基的顏色。經過一段時間的培養后，發現亞硒酸鈉質量濃度為5～8 μg/mL 的培養基底部呈紅色，且顏色隨其質量濃度的增大逐漸變深，表明這種嗜熱鏈球菌隨著亞硒酸鈉濃度的增加，轉化出的單質硒逐漸增多，有機硒則逐漸減少[6]，不宜作為最適加硒質量濃度。在適宜的硒質量濃度下，乳酸菌的生長代謝受到的影響程度較小[7]。因此，先選用前5 個培養基紅色不明顯的梯度（0、1、2、3、4 μg/mL，其中，0 為空白組）作為研究對象，初步研究乳酸菌富硒后的理化性質及抗氧化活性的變化。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 滴定酸度測定 其按照GB 5009.239—2016標準[8]進行，采用酚酞指示劑法測定滴定酸度，單位以°T 表示（為每 100 mL 樣品消耗 0.1 mol/L 的NaOH 溶液毫升數）。

1.3.2 pH 值測定 采用FE28-Standard pH 計測定pH 值。

1.3.3 黏度測定 采用黏度計測定黏度（測定條件為2 號轉子，轉速為6 r/min）。

式中，η 表示黏度，K 為系數，α 為轉子的偏轉量。

1.3.4 菌落數測定 按照GB 4789.2—2016 標準[9]測定菌落數（以M17 為培養基）。

1.3.5 抗氧化性測定

1.3.5.1 樣品處理 將10 mL 待測樣品與90 mL蒸餾水混勻，得到待測發酵乳。

1.3.5.2 對ABTS+的清除能力 將2.45 mmol/L 過硫酸鉀溶液與7 mmol/L 的ABTS 溶液以1∶1（V∶V）混勻，避光靜置 16 h，備用，用 pH 值 6.6、10 mol/L的PBS 稀釋混勻液體，使其在734 nm 下的吸光度值為0.70±0.02。取0.5 mL 樣品稀釋液，分別與5 mL 的ABTS 稀釋液和 pH 值為 6.6、10 mol/L 的 PBS 5 mL混勻，作為樣品組（A）s和對照組（A）c，同時以0.5 mL蒸餾水與5 mL 的ABTS 稀釋液混勻作為空白組（A0）。各組振蕩 30 s、暗反應 6 min、4 000 r/min 離心10 min，取上清液在734 nm處測定各組的吸光度值。

1.3.5.3 對DPPH·的清除能力 取3 mL 稀釋液，分別與 3 mL 蒸餾水和 3 mL 1.0×10-4mol/L 的DPPH 混勻，作為空白組（Ab）和樣品組（Ad），同時以稀釋液和 3 mL 無水乙醇混合作為對照組（An）。25 ℃避光條件反應 30 min，4 000 r/min 離心 10 min，測定上清液在517 nm 處的吸光度值。

1.3.5.4 總還原能力的測定 取稀釋發酵乳樣品的上清液，與 pH 值 6.6、0.2 mol/L的 PBS 2 mL 和 2 mL的1%鐵氰化鉀混合，50 ℃水浴20 min，加入2 mL的10%TCA，混勻離心后取上清液，加入0.5 mL 的0.1%FeCl3暗處反應至溶液澄清透明，測定樣品在700 nm 下的吸光度值。

1.4 數據統計分析

采用Microsoft Excel 2019 對數據進行統計分析；采用Origin 9.0 軟件進行制圖；采用Statistix 8.1軟件進行差異顯著性分析（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 添加不同質量濃度亞硒酸鈉對發酵乳酸度的影響

由圖1 可知，隨著亞硒酸鈉質量濃度的增加，發酵乳的滴定酸度呈現逐漸下降趨勢；當添加亞硒酸鈉為 4 μg/mL 時，滴定酸度最小，為 93.77°T；添加1、2 μg/mL 亞硒酸鈉與空白組間差異不顯著；添加亞硒酸鈉3、4 μg/mL 與空白組間差異達顯著水平（P＜0.05）。嗜熱鏈球菌產酸能力下降可能是由于加硒時間過早，一定程度抑制了菌體的代謝活動。宋照軍等[10]研究發現，嗜熱鏈球菌在對數期菌體代謝旺盛，對硒的轉化率較高，且加硒時間越早對菌體代謝活動抑制越強，選擇菌體對數期作為加硒時間段。

由圖2 可知，添加亞硒酸鈉質量濃度越大，嗜熱鏈球菌發酵乳的pH 值越高，這與滴定酸度的結果相符;發酵24 h 后，各組pH 值均低于4.2，嗜熱鏈球菌的產酸能力有所下降，基本停止產酸；當亞硒酸鈉質量濃度為 1、2、3 μg/mL 時，與 0、4 μg/mL 亞硒酸鈉間差異均達顯著水平（P＜0.05）。添加少量亞硒酸鈉使得發酵乳的pH 值略高于未添加組，說明亞硒酸鈉一定程度上可能影響了菌體的生長代謝活動。郜洪濤等[11]研究表明，嗜熱鏈球菌在發酵初期的產酸能力強，利用脫脂乳培養基中的乳糖使酸度積累，這與本研究結果一致。

2.2 不同質量濃度亞硒酸鈉對發酵乳黏度的影響

從圖3 可以看出，當添加亞硒酸鈉質量濃度為1、2 μg/mL 時，發酵乳的黏度低于空白組，但差異不顯著；其余2 組黏度顯著大于空白組（P＜0.05）。嗜熱鏈球菌在發酵過程中黏度的變化與胞外多糖的產量和酪蛋白的結構變化有關，嗜熱鏈球菌在發酵過程中產生的胞外多糖會與蛋白質形成膠體結構，包裹乳清，進而增加發酵乳的黏度[12]。此外，pH 值的下降會使發酵乳中酪蛋白的結構穩定性發生改變，粒子發生凝聚，分子團變大，從而使發酵乳的黏度增大[13]。

2.3 不同質量濃度亞硒酸鈉對發酵乳菌落數的影響

從圖4 可以看出，隨著亞硒酸鈉質量濃度的不斷增大，發酵乳中的菌落數逐漸減少，但不同質量濃度間差異不顯著；在發酵24 h 后，添加亞硒酸鈉的發酵乳菌落數均低于空白組，可能是由于發酵初期加硒時間過早，亞硒酸鈉的存在使菌株處于毒性環境中，同時培養基中亞硒酸鈉濃度的增加，使得發酵乳中無機硒的含量變高，菌株生長過程減緩[14]。PALOMO-SIGUERO 等[15]研究發現，當硒質量濃度增加到一定量時，乳酸菌的生長速度會下降，當補硒物質為亞硒酸鹽時，這種現象會更為明顯，這與本研究結果一致。

2.4 不同質量濃度亞硒酸鈉對發酵乳抗氧化性的影響

2.4.1 對ABTS 自由基清除率的影響 ABTS 自由基是一種水溶性陽離子自由基，而ABTS 可被ABAP、MnO2、H2O2等試劑氧化，生成藍綠色的自由基陽離子ABTS+，其在734 nm 處有最大吸收峰，在有供氫能力的抗氧化劑存在下，ABTS+與其反應，會變成沒有顏色的ABTS[16]，其可廣泛應用于食品抗氧化性的檢測。從圖5 可以看出，當添加亞硒酸鈉質量濃度為2 μg/mL 時，發酵乳的ABTS 自由基清除率達到98.31%，高于其余各組，但差異不顯著。在發酵乳中加入低濃度的亞硒酸鈉，可提高ABTS 自由基清除率。可能是由于嗜熱鏈球菌將一部分亞硒酸鈉轉化為有機硒，中和或轉化了自由基物質，提高了抗氧化性；另外，隨著亞硒酸鈉濃度的增加，發酵乳中菌落數逐漸減少，菌體結合自由基物質能力下降，使ABTS 自由基清除率降低。

2.4.2 對DPPH 自由基清除率的影響 DPPH 自由基是一種很穩定的以氮為中心的有機自由基，其孤對電子在517 nm 波長附近有強吸收；當有抗氧化劑存在時，孤對電子被配對，吸收消失或減弱，溶液由紫色變為淺黃色，可通過測定反應后吸光度值評價物質抗氧化活性[17]。從圖6 可以看出，當亞硒酸鈉質量濃度為2 μg/mL 時，對DPPH 自由基清除率最大，為65.89%，但與其余各組間差異不顯著。發酵乳中菌落數的減少，使亞硒酸鈉轉化為有機硒的含量降低，使得DPPH 自由基清除率降低；另外，嗜熱鏈球菌在發酵過程中產生的胞外多糖也可作為供氫物質與自由基反應，影響DPPH 自由基鏈式反應，使清除率降低[18]。

2.4.3 對發酵乳總還原力的影響 還原力是反映物質抗氧化活性的一種重要指標，還原劑的存在可以提供氫電子，從而破壞自由基鏈發揮抗氧化作用[19]。同時，抗氧化活性與還原力呈正相關，還原能力大，則抗氧化活性就強。SHEN 等[20]研究表明，動物芽孢桿菌01 蛋白質的總還原力隨著亞硒酸鈉質量濃度的增加而增大，蛋白質中硒的含量越大，則其總還原力越大。由圖7 可知，隨著亞硒酸鈉質量濃度的增大，發酵乳的總還原力也逐漸增大；當亞硒酸鈉質量濃度為4 μg/mL 時，其總還原力達最大，吸光度值為0.06，但與其余各組間差異不顯著。

3 結論與討論

本研究將不同質量濃度的亞硒酸鈉添加到脫脂乳培養基中，嗜熱鏈球菌發酵24 h 后，結果顯示，隨著亞硒酸鈉質量濃度的增大，發酵乳的滴定酸度和菌落數均有所下降，pH 值則逐漸增大；當亞硒酸鈉質量濃度為 2 μg/mL 時，黏度最低，但對 ABTS 自由基清除率和DPPH 自由基清除率最大；總還原力則與亞硒酸鈉質量濃度呈正相關，即質量濃度越大，發酵乳的總還原力越大。添加一定量的亞硒酸鈉，發酵乳的理化性質會有所改變；但發酵乳富硒后可以為機體補硒，保證硒的攝入量，同時發酵乳本身也具有營養價值。有關富硒發酵乳的安全性等仍需進一步研究。