TIM-3 在宮頸癌外周血 T 細胞中的表達及相關性研究

方曉丹，李娟，戴姝艷

（中國醫科大學附屬盛京醫院婦產科，沈陽 110004）

宮頸癌是威脅女性生命健康的婦科腫瘤疾病。在中國，每年有13.15 萬宮頸癌新發患者，占全球新發宮頸癌的28.8%［1］。高危型人乳頭瘤病毒 （human papilloma virus，HPV） 感染已確定與宮頸癌的發病密切相關，在宮頸癌中，HPV是位于皮膚表層的感染侵襲，因此奠定了T細胞介導的細胞免疫在宮頸癌免疫應答中的地位［2］。T細胞免疫球蛋白黏蛋白 （T cell immunoglobulin mucin domain containing molecules，TIM） -3是TIM家族中的一員。目前研究［3］表明，其在自身免疫性疾病、慢性病毒感染及腫瘤的發生發展中均發揮著重要的調控作用。TIM-3可與多種配體結合，進而抑制T細胞介導的免疫應答，參與誘導免疫耐受［4］。TIM-3已經被證實在非小細胞肺癌［5］、胃癌［6］、食管癌［7］和前列腺癌［8］等多種癌癥外周血T細胞中高表達，但有關TIM-3在宮頸癌外周血 T 細胞中的表達鮮有研究。因此，本研究主要檢測了宮頸癌患者外周血中CD4+T細胞和CD8+T細胞表達水平及T細胞中TIM-3的表達情況，并探討TIM-3的表達與宮頸癌患者病理參數的相關性，為TIM-3成為宮頸癌患者臨床免疫治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

研究標本來自2017年8月至2018年1月于中國醫科大學附屬盛京醫院婦科病房住院手術的患者。觀察組包括宮頸上皮內瘤變 （cervical intraepithelial neoplasia，CIN） Ⅱ～Ⅲ期15例，年齡范圍為23～55歲；宮頸癌患者24例，年齡范圍為30～63歲。對照組為術后石蠟病理證實為畸胎瘤且宮頸篩查未見異常 （宮頸HPV檢測為陰性且液基細胞學檢查未見上皮內病變）的患者，共21例，年齡范圍為20～42歲。2組患者年齡等一般資料無統計學差異 （P＞ 0.05）。根據國際婦產科協會 （Federation International of Gynecology and Obstetr，FIGO） 臨床分期（2009年） 將宮頸癌患者分為Ⅰ～Ⅱ期16例，Ⅲ～Ⅳ 期8例，所有患者均簽署知情告知同意書，研究獲得中國醫科大學盛京醫院倫理委員會批準。納入標準： （1） 所有患者均非親屬關系；（2） 所有病例組患者均經病理學證實，CIN 患者均經術后病理證實，宮頸癌患者為原發性宮頸癌，不伴有其他腫瘤疾病；（3） 所有患者均為未進行放療或者化療的初診患者。排除標準： （1） 1個月內接受過輸血治療的患者；（2） 合并免疫系統疾病或使用過免疫相關藥物的患者；（3） 2周內進行過抗炎治療的患者。

1.2 儀器與試劑

人淋巴細胞分離液 （天津灝洋生物制品科技有限公司）；Multifuge 3SR+臺式冷凍離心機 （德國赫利氏公司）；流式細胞儀 （美國BD公司的BD FACSCalibur型流式細胞儀）；FITC標記的鼠抗人CD4單克隆抗體 （貨號：555346，美國 BD 公司）；PECy5標記的鼠抗人CD8單克隆抗體 （貨號：555636，美國 BD 公司）；PE標記的鼠抗人TIM-3單克隆抗體 （貨號：fab2365p，美國RD公司）。

1.3 方法

取所有受試者清晨空腹靜脈外周血2 mL，使用肝素鈉抗凝管常溫保存。用密度梯度離心法提取外周血單個核細胞 （peripheral blood mononuclear cell，PBMC），將PBMC 懸液中加入5倍體積 PBS混勻，水平2 000 r/min離心5 min，4 ℃。棄上清，PBS重懸后加入PE-Cy5標記的鼠抗人CD4 單克隆抗體、FITC標記的鼠抗人CD8單克隆抗體、PE標記的鼠抗人TIM-3抗體進行標記，避光孵育30 min；采用PBS清洗2次，1 200 r/min離心5 min，棄上清，加入PBS重懸。采用流式細胞術檢測CD4+T細胞，CD8+T細胞及細胞表面TIM-3的表達。

1.4 統計學分析

所有標本經過 Flowjo7.6.5分析，數據錄入SPSS 22.0統計軟件進行統計學分析，并使用GraphPad Prism 6軟件繪制圖形。計量數據以表示，采用LSD-t檢驗進行多個樣本均數兩兩之間的比較，計數資料統計采用Fisher確切法，P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 宮頸癌患者外周血T 細胞的表達

熒光標記宮頸病變患者及非宮頸病變患者外周血CD4+T細胞及CD8+T細胞，流式細胞儀分析后數據再進行統計學分析。結果表明，在宮頸病變患者中，宮頸癌 （18.54%±7.52%） 及CIN患者 （21.29%±11.31%） 外周血中的CD4+T細胞百分比明顯低于非宮頸病變患者 （30.43%±8.43%），差異有統計學意義 （P＜ 0.05），但是宮頸癌與CIN變患者之間無統計學差異。CIN外周血中的CD8+T細胞百分比 （20.38%±9.79%） 較非宮頸病變患者 （27.35%±11.67%） 明顯降低，差異有統計學意義 （P＜ 0.05）。宮頸癌患者外周血中的CD8+T細胞百分比 （16.17%±9.27%） 也較非宮頸病變患者（27.35%±11.67%） 明顯降低，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。而宮頸癌患者與CIN患者外周血中的CD8+T細胞百分比無統計學差異。

2.2 TIM-3 在宮頸癌患者外周血T 細胞表面的表達

流式細胞儀方法分析TIM-3在外周血 CD4+T 及CD8+T細胞的表達 （圖1、2），結果顯示，TIM-3 在CIN患者及宮頸癌患者外周血CD4+T 細胞表面的表達量分別為8.24%±9.58%及8.38%±9.13%，高于對照組的表達量（3.41%±2.82%），差異有統計學意義 （P＜0.05）。TIM-3 在CIN患者及宮頸癌患者外周血CD8+T細胞表面的表達量分別17.72%±10.55%及18.78%±10.22%，較對照組的表達量（11.11%±5.49%）高，差異有統計學意義 （P＜ 0.05）。而宮頸癌患者與CIN患者外周血 CD8+T 細胞表面的表達量無統計學差異。

2.3 TIM-3在宮頸癌患者外周血T細胞表達與臨床病理因素的關系（表1）

圖1 TIM-3在對照組、CIN 患者及宮頸癌患者外周血 CD4+T 細胞上的表達Fig.1 TIM-3 expression on CD4+T-cells in the peripheral blood of a healthy control，a CIN patient，and a cervical carcinoma patient

圖2 TIM-3在對照組、CIN 患者及宮頸癌患者外周血 CD8+T 細胞上的表達Fig.2 TIM-3 expression on CD8+T-cells in the peripheral blood of a healthy control，a CIN patient，and a cervical carcinoma patient

對24位宮頸癌患者進一步分析，結果顯示，Ⅲ～Ⅳ期患者外周血中的TIM-3在CD4+T及CD8+T細胞中的百分比與I～Ⅱ期比較有統計學差異，TIM-3在宮頸癌外周血 T 細胞表面的表達水平與 FIG0 （2009年） 臨床分期相關 （P＜ 0.05），與淋巴結轉移、腫物大小、年齡及鱗狀細胞癌抗原值高低無相關性 （P＞0.05）。

表1 TIM-3在T細胞的表達水平與不同臨床病理因素間的關系Tab.1 Relationship between the expression of TIM-3 on T cells and the patients’ clinicopathological parameters

3 討論

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤，在病毒感染初期CD4+T （Th0） 細胞在接受到不同信號的刺激后，分別向適應機體條件的方向分化，腫瘤微環境中T細胞的功能障礙或衰竭是腫瘤發病的關鍵機制［9-10］。目前，恢復功能障礙T細胞的抗腫瘤活性已成為腫瘤免疫治療領域的研究熱點［11-12］。

TIM-3是TIM家族中的一員，于2002年首次于小鼠Th1及CD8+T細胞上被發現［4］，隨后的研究［13-16］表明TIM-3也表達于樹突細胞 （dendritic cell，DC）、自然殺傷 （natural killer，NK）細胞及肥大細胞等固有免疫細胞表面。TIM-3在慢性病毒感染和腫瘤中起負性免疫調節作用，其持續表達能誘導T細胞的凋亡，導致T細胞功能耗竭［17-19］。JONES等［20］研究表明，TIM-3在獲得性免疫缺陷綜合征患者的CD4+T細胞和CD8+T細胞表面高表達，與CD4+T細胞數量成反比，與血漿中病毒載量呈正相關。在慢性乙型病毒感染性肝炎患者中，TIM-3在乙型肝炎病毒特異性 CD8+T細胞表面的表達水平明顯升高，通過阻斷Gal-9/TIM-3信號通路可以有效恢復乙型肝炎病毒特異性CD8+T細胞的功能［21-22］。但TIM-3 在宮頸癌領域少有研究，本研究結果顯示，宮頸病變 （宮頸癌及CIN） 患者較非宮頸病變患者外周血CD4+T細胞及CD8+T細胞減少，但外周血CD4+T細胞及CD8+T細胞表面的TIM-3表達水平明顯升高，與TIM-3在其他疾病中的研究結果一致。本課題組的前期研究［23］顯示，Galetin-9在宮頸鱗狀癌中過度表達，并且與FIGO（2009 年） 分期呈正性作用，以上結果均與本研究的結果契合。TIM-3作為免疫負性調節家族中一員，其高表達可誘導T細胞凋亡，導致T細胞功能耗竭，使宮頸病變患者CD4+T細胞及CD8+T細胞的表達百分比減少，從而促進宮頸癌的發生發展。

本研究進一步深入分析了宮頸癌的不同臨床病理因素與TIM-3在外周血T細胞表達水平的關系。結果顯示，TIM-3在外周血T細胞的表達水平與宮頸癌的分期呈正相關。與年齡、腫瘤大小、淋巴結轉移及鱗狀細胞癌抗原升高無相關性。說明宮頸癌的發生的發展可能是一個多因素多環節的過程。

本研究結果顯示，TIM-3在宮頸癌外周血T細胞表面高表達，并且與分期呈正性關系，對宮頸癌的早期病毒感染期的預防治療提供依據，同時為疾病的靶向特異性治療提供理論依據。然而本研究對于TIM-3在宮頸癌中具體的作用機制并未進行深入研究，并且缺乏組織水平上研究，日后仍然需要大量實驗進一步研究。TIM-3很可能成為一種新的免疫學治療靶點。