珍珠舌草膠囊全方對(duì)胃癌細(xì)胞增殖與凋亡的影響及機(jī)制研究*

譚 寶，張 潔，馮五金，高麗萍，智雪峰，蘇娟萍△

（1.山西省中醫(yī)院，山西 太原 030000；2.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，山西 太原 030000；3.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 太原 030000）

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，全球每年新增確診病例約 93.4萬(wàn)，位居所有惡性腫瘤的第2位[1]。胃癌是全球公認(rèn)的高發(fā)病率的癌變疾病，雖然全球胃癌的發(fā)病率在下降，然而亞洲國(guó)家的胃癌致死率卻仍在上升[2]，胃癌也是我國(guó)的高發(fā)疾病。研發(fā)高效、低毒的化療新藥和新的治療方案對(duì)胃癌的治療具有重要意義。

課題組根據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)理論及多年臨床經(jīng)驗(yàn)，研制出珍珠舌草膠囊，其由黃芪、枳實(shí)、白術(shù)、木香、砂仁、丹參、莪術(shù)、珍珠層粉、蒲公英、白花蛇舌草等組成，用于治療胃癌前病變。經(jīng)臨床反復(fù)驗(yàn)證，累計(jì)治療慢性萎縮性胃炎（CAG）患者近萬(wàn)例，發(fā)現(xiàn)其在改善慢性萎縮性胃炎臨床癥狀，降低胃黏膜慢性炎癥、腸上皮化生、異型增生、Hp感染等方面作用顯著[3-7]。慢性萎縮性胃炎伴癌前病變和胃癌關(guān)系密切，查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，慢性萎縮性胃炎伴癌前病變和胃癌的病因病機(jī)、治療方法有許多相同之處[8-10]。

珍珠舌草膠囊全方能有效治療胃癌前病變，對(duì)胃癌可能有一定治療效果，因此認(rèn)為有必要針對(duì)珍珠舌草膠囊的抗腫瘤作用進(jìn)行研究。珍珠舌草膠囊中的組成中藥具有增強(qiáng)免疫力及抗腫瘤活性，應(yīng)用珍珠舌草膠囊抗腫瘤研究具有現(xiàn)代藥理學(xué)理論基礎(chǔ)[11-14]。故本研究在珍珠舌草膠囊有效治療慢性萎縮性胃炎伴癌前病變基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討其抗腫瘤作用，以期為其臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞、試劑與儀器 AGS細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。Ham’s/F-12培養(yǎng)液購(gòu)于北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；胎牛血清（FBS）購(gòu)于杭州四季青生物工程有限公司；DMSO（二甲基亞楓）和RNase A（核糖核酸酶A）購(gòu)于金科宏達(dá)生物公司；MTT購(gòu)于上海日初生物科技有限公司；PI（propidium iodide，碘化丙啶）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；胰酶購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；33342/PI試劑盒購(gòu)于中國(guó)Beyotime公司；Annexin V購(gòu)于美國(guó) BioVision公司；SpectraMAX 190微孔讀板機(jī)購(gòu)于美國(guó)分子儀器公司（MD，USA）；FACScan流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)BD公司（Becton Dickinson，USA）；ModFitLT V3.0 軟件和熒光顯微鏡購(gòu)于日本Olympus公司。

1.2 藥物制備 珍珠舌草膠囊由黃芪、枳實(shí)、白術(shù)、木香、砂仁、丹參、莪術(shù)、珍珠層粉、蒲公英、白花蛇舌草等組成，藥物由山西省中醫(yī)藥研究院中藥房提供，生藥鑒定由本研究中心完成并提供詳實(shí)的鑒定報(bào)告。取珍珠舌草膠囊復(fù)方飲片1帖，加入8倍量95%乙醇浸泡12 h，武火煮沸后改用文火保持微沸2 h，過濾，濾渣重新加入約8倍95%乙醇，繼續(xù)加熱，重復(fù)提取2次，合并濾液，轉(zhuǎn)移濾液至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，回收乙醇至不再蒸出，將提取物水浴揮干水分后轉(zhuǎn)移至真空干燥箱減壓低溫干燥。待干燥后用研缽研成細(xì)粉備用。

1.3 胃癌AGS細(xì)胞培養(yǎng) AGS細(xì)胞培養(yǎng)在含10%FBS、1%雙抗的Ham’s/F12完全培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。視培養(yǎng)液顏色和細(xì)胞生長(zhǎng)狀況決定是否換液，當(dāng)細(xì)胞貼壁達(dá)80%左右，用0.25%胰酶溶液消化傳代。

1.4 細(xì)胞活力檢測(cè) AGS細(xì)胞以1.0×104個(gè)/mL接種于96孔板內(nèi)，每孔200 μL，貼壁24 h后，換上含藥培養(yǎng)基，以含DMSO培養(yǎng)基做陰性對(duì)照，珍珠舌草膠囊藥物濃度為0.25、0.5、1.0 mg/mL，干預(yù)細(xì)胞生長(zhǎng)24、48 h，然后加入 20 μL 5 mg/mL MTT 溶液，繼續(xù)孵育4 h，去除含MTT的培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO，振蕩 15 min，570 nm 處測(cè)定吸光值（OD），根據(jù)公式（藥物組/對(duì)照組OD值）*100%計(jì)算細(xì)胞活力。

1.5 細(xì)胞周期檢測(cè) AGS細(xì)胞以2.5×104個(gè)/mL接種于6孔培養(yǎng)板，每孔3 mL，過夜待細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)液換成不含血清的培養(yǎng)基，饑餓以同步，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，換上不同濃度的含藥培養(yǎng)基，珍珠舌草膠囊藥物濃度為0.25、0.5、1.0 mg/mL，細(xì)胞分別培養(yǎng)24、48 h，0.25%的胰酶消化細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS終止消化，吹打細(xì)胞，移入離心管中。棄上清，冷PBS洗2次，離心去PBS，加入1 mL PBS重懸細(xì)胞，加入預(yù)冷的無(wú)水乙醇固定，4℃，6 h以上。1 000 r/min離心5 min棄去固定液，2 mL冷PBS洗2次，離心后棄上清。4℃，PI染液染色，避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè) AGS細(xì)胞以2.5×104個(gè)/mL接種于6孔培養(yǎng)板，每孔3 mL，貼壁24 h后，將培養(yǎng)液換成不含血清的培養(yǎng)基，饑餓以同步，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，換上不同濃度的含藥培養(yǎng)基，珍珠舌草膠囊藥物濃度為 0.25、0.5、1.0 mg/mL，細(xì)胞培養(yǎng) 24、48 h，到作用時(shí)間后，收集細(xì)胞上清，加0.125%胰酶消化細(xì)胞，37℃約1 min，加細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，輕柔吹打細(xì)胞，并收集細(xì)胞與上清一起，切忌損傷細(xì)胞。冰冷PBS（4 mL）中離心，300×g，5 min，棄上清，旋渦振蕩器點(diǎn)動(dòng)分散細(xì)胞后，加入4 mL Annexin V結(jié)合緩沖液再次洗滌細(xì)胞，棄上清。加入500 μL Annexin V結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，隨后加入FITC標(biāo)記的Annexin V 1 μL（終濃度 1 μg/mL），再次點(diǎn)動(dòng)混勻，隨后冰浴 30 min，中間取出再混勻一次。染色結(jié)束后，加入4 mL Annexin V結(jié)合緩沖液洗滌細(xì)胞，棄上清，加入500 μL Annexin V結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，置于冰浴中保存。上機(jī)前加入PI（終濃度5 μg/mL），并立即上機(jī)檢測(cè)。

1.7 Caspase-3活性檢測(cè) AGS細(xì)胞以2.5×104個(gè)/mL接種于6孔培養(yǎng)板，每孔3 mL，貼壁過夜，換上不同濃度的含藥培養(yǎng)基，珍珠舌草膠囊藥物濃度為0.25、0.5 mg/mL，細(xì)胞培養(yǎng) 24、48 h，0.25%胰酶消化，細(xì)胞數(shù)需達(dá) 1～5×106個(gè)，1 500 r/min，離心 5 min，懸浮細(xì)胞于50 μL冰冷細(xì)胞裂解液中裂解10 min，10 000×g離心1 min，收集上清，冰上放置，然后進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，將50～200 μg蛋白用細(xì)胞裂解液補(bǔ)充至50 μL，加入 50 μL 的 2×反應(yīng)緩沖液（含 10 mM DTT），加入5 μL 4 mM 的 DEVD-pNA（200 μM 終濃度），37 °C孵育1～2 h，405 nm處測(cè)定吸光值（OD）。

2 結(jié)果

2.1 珍珠舌草膠囊全方對(duì)AGS細(xì)胞活力的影響珍珠舌草膠囊干預(yù)胃癌細(xì)胞后，通過顯微鏡下觀察，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，形態(tài)學(xué)也發(fā)生一定變化，部分細(xì)胞發(fā)生脫落、變圓，細(xì)胞壁邊緣毛糙。從MTT結(jié)果可見，珍珠舌草膠囊干預(yù)胃癌細(xì)胞24、48 h，能呈劑量和時(shí)間依賴性的抑制AGS細(xì)胞生長(zhǎng)。與DMSO對(duì)照組相比，0.25、0.5、1.0 mg/mL的珍珠舌草膠囊干預(yù)細(xì)胞24 h，可使AGS細(xì)胞活力從69.5%下降至14.5%；干預(yù)細(xì)胞48 h，可使AGS細(xì)胞活力從53.4%下降至9.26%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見圖1。

圖1 珍珠舌草膠囊全方對(duì)AGS細(xì)胞活力的影響

2.2 珍珠舌草膠囊全方對(duì)AGS細(xì)胞周期的影響為了探討珍珠舌草膠囊全方抑制胃癌細(xì)胞增殖的可能機(jī)制，檢測(cè)了其干預(yù)胃癌細(xì)胞24、48 h后細(xì)胞周期的變化。結(jié)果表明，珍珠舌草膠囊全方能阻滯胃癌細(xì)胞周期于G2/M期，能顯著增加處于G2/M期的細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞數(shù)從16.29%上升至29.02%，而干預(yù)胃癌細(xì)胞 48 h，G2/M期的細(xì)胞數(shù)從 21.15%增加到37.67%。表明珍珠舌草膠囊全方干預(yù)細(xì)胞24、48 h均能阻滯胃癌細(xì)胞周期于G2/M期，見圖2、圖3。

2.3 珍珠舌草膠囊全方對(duì)AGS細(xì)胞凋亡的影響 細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果表明，珍珠舌草膠囊全方0.25、0.5、1.0 mg/mL干預(yù)胃癌細(xì)胞24 h后，早期凋亡率分別為3.4%、10.0%、16.1%，干預(yù)48 h后，早期凋亡率分別為5.4%、11.3%、20.2%，提示珍珠舌草膠囊全方促細(xì)胞凋亡有時(shí)間和劑量依賴性，與對(duì)照組相比，0.5、1.0 mg/mL組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見圖 4、圖 5。

2.4 珍珠舌草膠囊全方對(duì)Caspase-3活性的影響 珍珠舌草膠囊全方干預(yù)AGS細(xì)胞24 h，0.25、0.5 mg/mL組Caspase-3的活性分別是對(duì)照組的2.56倍和3.69倍，干預(yù)48 h后，是對(duì)照組的2.73倍和7.32倍。提示珍珠舌草膠囊全方能呈時(shí)間和劑量依賴性地增加Caspase-3的活性，與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見圖 6。

圖2 珍珠舌草膠囊全方對(duì)胃癌細(xì)胞周期的影響（24 h）

圖3 珍珠舌草膠囊對(duì)胃癌細(xì)胞周期的影響（48 h）

圖4 珍珠舌草膠囊全方醇提物對(duì)胃癌細(xì)胞早期凋亡的影響（24 h）

圖5 珍珠舌草膠囊全方醇提物對(duì)胃癌細(xì)胞細(xì)胞凋亡的影響（48 h）

圖6 珍珠舌草膠囊對(duì)Caspase-3活性的影響

3 討論

本研究結(jié)果表明，珍珠舌草膠囊能夠抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)，阻滯胃癌細(xì)胞周期于G2/M期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，明顯增強(qiáng)Caspase-3的活性。細(xì)胞增殖與凋亡的平衡對(duì)于保持胃腸粘膜的完整性具有重要意義[15-16]。一旦這種平衡被破壞，就會(huì)誘發(fā)慢性萎縮性胃炎或胃癌前病變甚至是腫瘤。慢性萎縮性胃炎伴癌前病變是胃癌的重要誘發(fā)因素，因?yàn)橹匕Y胃炎破壞了胃粘膜的上皮細(xì)胞，最終正常的胃粘膜上皮細(xì)胞被具有較高增殖率的腸上皮細(xì)胞和異型增生細(xì)胞取代，導(dǎo)致了慢性腸化生和異型增生的出現(xiàn)。腸化生和異型增生打破了正常胃粘膜細(xì)胞增殖與凋亡的平衡，增加了胃癌的發(fā)生機(jī)率[17]。目前缺乏治療胃癌伴癌前病變的有效藥物，而中醫(yī)藥治療該病取得了較好的臨床效果。

珍珠舌草膠囊為臨床經(jīng)驗(yàn)方，可以有效治療慢性萎縮性胃炎伴癌前病變，對(duì)胃癌前病變細(xì)胞的增殖有良好的阻斷作用。周期阻滯和誘導(dǎo)凋亡是抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的兩個(gè)重要因素[18-19]。死亡受體和線粒體依賴途徑是細(xì)胞凋亡的主要途徑[20]。Caspase-3是這兩條途徑的一個(gè)主要環(huán)節(jié)，因此它在細(xì)胞凋亡中起到非常重要的作用。細(xì)胞凋亡是在基因控制下的細(xì)胞自我消亡過程，腫瘤的形成一方面是增殖分化異常，分化不良增殖過度，另一方面是誘導(dǎo)凋亡的基因突變，抑制凋亡的基因過度表達(dá)使得凋亡不足[21]。珍珠舌草膠囊全方干預(yù)AGS細(xì)胞24、48 h后，Caspase-3的活性均明顯升高，并且作用呈現(xiàn)出一定的時(shí)間和劑量依賴性。提示珍珠舌草膠囊促進(jìn)AGS細(xì)胞凋亡，可能與其增強(qiáng)了Caspase-3的活性有關(guān)。

分析以上結(jié)果可知，珍珠舌草膠囊全方能夠抑制ACS細(xì)胞生長(zhǎng)，其抑制細(xì)胞增殖的作用可能與阻滯細(xì)胞周期，促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡有關(guān)，而促凋亡作用可能通過升高Caspase-3的活性實(shí)現(xiàn)。上述結(jié)果說(shuō)明，珍珠舌草膠囊在體外實(shí)驗(yàn)中具有一定的抗腫瘤活性，下一步將進(jìn)行拆方研究，進(jìn)一步明確抗腫瘤有效成分，為臨床更好地應(yīng)用珍珠舌草膠囊提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。