青海湖裸鯉foxk1基因克隆和初步功能分析

閔倩雯， 張顯波， 周其椿*， 李建光， 曾 圣， 陳飛雄， 楊 興

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學院 水產(chǎn)研究所， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州省特種水產(chǎn)工程技術中心， 貴州 貴陽 550025)

青海湖裸鯉(Gymnocyprisprzewalskii)屬鯉形目，鯉科，裂腹魚亞科，裸鯉屬，俗稱湟魚、花魚、狗魚、無鱗魚,為喜冷魚類，分布于青海湖及其支流、克魯克湖、扎陵湖及鄂陵湖，其肉質鮮嫩可口，是青海湖中唯一的經(jīng)濟魚類。近年來由于自然和人為因素影響，青海湖裸鯉資源急劇下降，甚至面臨衰竭的危險。貴州省冷水資源量巨大，水質良好，水溫常年穩(wěn)定在11～25℃，適宜養(yǎng)殖高品質冷水性魚類。與北方冬季嚴寒期長，南方夏季水溫偏高相比，貴州養(yǎng)殖冷水魚普遍沒有“半年養(yǎng)半年閑”的現(xiàn)象，十分適宜養(yǎng)殖青海湖裸鯉。貴州省農(nóng)業(yè)科學院水產(chǎn)研究所前期從青海引進該品種進行養(yǎng)殖觀察，該品種已完全適應貴州養(yǎng)殖環(huán)境。對青海湖裸鯉展開生殖生理學研究，對解析其性腺發(fā)育機制具有重要意義，為其接下來的人工擴繁和分子遺傳育種研究奠定理論基礎。

魚類生殖生理受多個信號通路的共同調控，其中轉錄因子叉頭框(Fox)家族成員對脊椎動物性腺發(fā)育過程必不可少。Fox家族的范圍從FoxA到FoxS，包含100多種蛋白質[1]。所有的Fox蛋白都具有一個保守的DNA結合結構域，該結構具有帶翼的螺旋結構，該結構由3個α螺旋和2個類似蝴蝶的翼組成[2]。Fox基因家族編碼多個叉頭蛋白，這些叉頭蛋白表現(xiàn)出顯著的功能多樣性，并參與多種生物學過程。在哺乳動物中，叉頭基因對于許多生物過程至關重要，包括發(fā)育、代謝過程、性別分化、繁殖和細胞周期調控等[1,3-5]。foxk1是Fox家族的成員之一，含有叉頭關聯(lián)結構域(forkhead-associated domain)，用于識別磷酸肽和DNA結合結構域，起到轉錄調控下游基因的作用[6-7]。foxk1依賴于其轉錄活性，介導廣泛的生物過程。例如，foxk1通過與轉錄抑制復合物Sin3/Sds3相互作用激活肌源性祖細胞[8-9]；通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進細胞生長[10-11]；在重新編程細胞代謝以誘導有氧糖酵解中扮演重要的調節(jié)因子[12]；foxk1通過抑制53BP1定位于DNA損傷位點而負調控53BP1的功能，從而改變DSB誘導的以53BP1為中心的蛋白復合物，從而影響DNA修復的選擇[13]。然而，foxk1在脊椎動物性腺發(fā)育過程中的功能和作用少見報道。因此，圍繞青海湖裸鯉卵巢中的foxk1基因克隆和功能開展相關研究，為青海湖裸鯉的卵巢發(fā)育機制研究提供理論基礎數(shù)據(jù)，以期對脊椎動物生殖生理學和繁殖生物學研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

青海湖裸鯉從青海湖裸鯉救護中心引進，貴州省農(nóng)業(yè)科學院水產(chǎn)研究所試驗基地培育，于自然光周期下22℃恒溫循環(huán)水系統(tǒng)中飼養(yǎng)。投喂?jié)h業(yè)飼料，早中晚各1次。

1.2 青海湖裸鯉foxk1基因克隆

根據(jù)GenBank中報道的相關物種的foxk1基因序列，在基因保守區(qū)域設計合成簡并引物，用此簡并引物進行foxk1部分基因片段擴增及測序，獲取青海湖裸鯉foxk1基因中間部分序列，并通過5′-RACE(Rapid-amplifiction of cDNA ends)和3′-RACE及與其它魚類基因組序列比對獲取foxk1基因全序列。

1.3 foxk1基因的系統(tǒng)進化分析

進化樹包括人(human，Homosapiens)(NP_001032242.1)、小鼠(mouse，Musmusculus)(NP_951031.2)、雞(chicken，Gallusgallus)(XP_015149844.1)、蜥蜴(lizard，Zootocavivipara)(XP_034986413.1)、金線鲃(golden-linebarbel，Sinocyclocheilus grahami)(XP_016122830.1)、金魚(goldfish，Carassiusauratus)(XP_026057237.1)、鯉魚(common carp，Cyprinuscarpio)(XP_018923732.1)、斑馬魚(zebrafish，Daniorerio)(NP_956196.1)、斑點雀鱔(spotted gar，Lepisosteusoculatus)(XP_006637172.1)和研究克隆的青海湖裸鯉foxk1氨基酸序列。進化樹以NJ法采用MEGA 6.0構建。斑馬魚foxk2(NP_001184186.1)氨基酸序列作為外類群。進化樹中數(shù)值表示這一分支的可靠程度。

1.4 脊椎動物foxk1基因共線性分析

脊椎動物foxk1基因及其相鄰基因圖譜的構建分析在Ensembl Genome Browser(http://www.ensembl.org)網(wǎng)頁上進行。

1.5 青海湖裸鯉foxk1組織表達模式分析

通過RT-PCR技術分析青海湖裸鯉foxk1在成魚各個組織中的表達情況。解剖24月齡青海湖裸鯉，取其腦、垂體、鰓、心臟、肝臟、腸、脾臟、頭腎、性腺、肌肉和腎臟放于液氮速凍。按照RNAiso Plus操作說明提取總RNA，DNase I處理，逆轉錄合成cDNA，用基因特異引物進行擴增，檢驗foxk1在各個組織中的分布情況。以青海湖裸鯉β-actin作為內參。以卵巢cDNA模板為陽性對照，以雙蒸水模板為陰性對照。

1.6 青海湖裸鯉foxk1基因在各時期卵巢中的表達情況

取3、6、9、12、18、24月齡青海湖裸鯉卵巢液氮速凍，提取總RNA，合成cDNA。采用Real-time PCR檢測foxk1基因在各時期青海湖裸鯉卵巢中的表達情況。管家基因β-actin作為內參，目標基因mRNA的相對表達水平采用公式R= 2-△△Ct方法計算[14]。結果表示為Ct值的平均值±標準偏差，采用SPSS進行顯著性分析，組間差異采用單因素方差(one-way ANOVA)分析Duncan's post-hoc檢驗，顯著性水平設置為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 青海湖裸鯉foxk1 cDNA和氨基酸全序列

基于RT-PCR和RACE分析顯示，青海湖裸鯉foxk1全長cDNA序列為2 251 bp，包括5′端79 bp的非編碼區(qū)，1 944 bp的蛋白質編碼區(qū)和3′端228 bp非編碼區(qū)；開放閱讀框編碼647個氨基酸(圖1)。

2.2 脊椎動物foxk1序列對比和系統(tǒng)聚類

通過氨基酸序列的比對，foxk1在脊椎動物間有高度相似性，含有forkhead associated domain和Forkhead domain結構域；克隆的青海湖裸鯉foxk1與人、小鼠、雞、蜥蜴、斑點雀鱔、金線鲃、金魚、鯉魚、斑馬魚foxk1間的氨基酸序列相似性分別為68.2%、69.3%、76.8%、69.6%、82.8%、94.4%、93.2%、94.1%、93.4%(圖2)。

系統(tǒng)進化樹分析顯示，人、小鼠、雞、蜥蜴的Foxk1氨基酸序列聚為一支，魚類斑點雀鱔、金魚、鯉魚、斑馬魚、金線鲃、青海湖裸鯉的Foxk1氨基酸序列聚為一支(圖3)。

2.3 脊椎動物foxk1基因共線性

共線性分析顯示，foxk1與其鄰近基因gnal2、cardl1、sdk1、ap5z1、radil、mmd2在人、小鼠、雞和龜中的共線性高度保守，腔棘魚的gnal2、cardl1、sdk1、mmd2不共線；魚類中，除斑馬魚外，foxk1與其鄰近基因gnal2、sdk1、radil、mmd2高度保守；4足類和魚類只有gnal2、sdk1、mmd2和foxk1的共線性保守(圖4)。

2.4 青海湖裸鯉foxk1組織表達模式

從圖5可知，foxk1高表達于雌雄個體的垂體和性腺，中量表達于雌雄個體腦，微量表達于雌雄個體鰓和心臟。

2.5 青海湖裸鯉foxk1在卵巢不同發(fā)育階段的表達

從圖6看出，經(jīng)Real-time PCR分析，foxk1在3、6、9、12、18、24月齡卵巢中都存在表達，在3月齡和6月齡表達量最低，9月齡持續(xù)顯著升高，后期持續(xù)高表達。

3 結論與討論

成功克隆的青海湖裸鯉foxk1基因，含有forkhead associated domain和Forkhead domain結構域；系統(tǒng)進化樹分析顯示，以斑馬魚Foxk2作為外類群，克隆的foxk1與其它脊椎動物的foxk1聚為一支，且克隆的foxk1與其它脊椎動物的foxk1序列同源性最低為68.2%，最高達94.4%；共線性分析顯示，4足類foxk1基因及相鄰基因相當保守；魚類的foxk1基因及相鄰基因的共線性十分保守，斑馬魚的不保守型也可能是由于測序拼接不完整造成。

foxk1作為轉錄因子，在生物的多種信號通路和器官發(fā)育中起重要作用。研究結果顯示，foxk1在檢測的青海湖裸鯉的多個組織中有表達，說明該基因的功能是多元化的。foxk1在3月和6月卵巢中低表達，在9月及后期卵巢中高表達，說明foxk1主要在卵巢卵母細胞發(fā)育和成熟過程中起作用。在大鯢中的研究顯示，foxk1在卵巢中也存在高表達，且存在溫度依賴性，相對于20℃和28℃，在24℃飼養(yǎng)的大鯢卵巢中foxk1表達最高[15]。foxk1參與脊椎動物卵巢發(fā)育，但其具體功能和作用機制還有待進一步研究。