枸杞蛋白提取工藝的優(yōu)化

吳啟康， 楊芝芝， 陳周秀， 羅家敏， 吳鴻億， 郝愛平*

(1.牡丹江師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 黑龍江 牡丹江 157012； 2.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 甘肅 蘭州 730124; 3.西北民族大學(xué) 化工學(xué)院， 甘肅 蘭州 730124)

枸杞(Lyciumbarbarum)為茄科植物多年生落葉灌木的干燥成熟果實(shí)。在朝鮮、日本、歐洲大部分地區(qū)均有種植，中國(guó)主要分布在寧夏、甘肅、新疆、青海、陜西、山西及河北等地?！吨袊?guó)藥典》注明，僅有寧夏枸杞入中藥，因此中國(guó)寧夏枸杞子最為盛名[1]。由于枸杞在中國(guó)藥學(xué)研究中具有很大的藥用價(jià)值，現(xiàn)代科學(xué)對(duì)其研究越來(lái)越多，涉及枸杞多糖、黃酮、揮發(fā)油、生物堿和類胡蘿卜素等[2-4]。然而大部分研究主要集中在枸杞種植、黃酮功效、多糖功效及揮發(fā)性組分分析等[5]，對(duì)枸杞蛋白的研究較少。

蛋白的來(lái)源主要分為動(dòng)物來(lái)源和植物來(lái)源。動(dòng)物性蛋白更利于人類攝取，但是成本過(guò)高。植物性蛋白是世界上最大的可再生蛋白資源之一[6]，其來(lái)源廣，具有抗氧化、抗菌、降低血糖血脂、降低血壓和免疫活性等功能[7-10]。近年來(lái)，由于肽可以維護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)人體生理功能[11]，利用植物性蛋白制備生物肽用于保健品、醫(yī)療等領(lǐng)域逐漸增加。有研究發(fā)現(xiàn)，生物活性肽具有抗氧化、抗癌以及抗突變等活性[12-14]。將枸杞進(jìn)行深加工，利用枸杞蛋白制備生物活性肽可提高其經(jīng)濟(jì)效益。

蛋白提取方法較多，由于水溶性蛋白易溶解于堿性環(huán)境而不溶于酸性環(huán)境，酸堿環(huán)境創(chuàng)造成本低廉，因此，堿提酸沉法是成本較為低廉的蛋白提取方法。安家靜等[15]對(duì)比堿提酸沉法和酶法兩種提取方法提取薏仁碎米中蛋白，提取率無(wú)顯著差異，酶法提取時(shí)間短，但溫度控制要求較高，溫度偏差容易導(dǎo)致酶失活，且酶的價(jià)格較高。相比之下堿提酸沉法對(duì)溫度無(wú)明顯要求，因此較適合用于蛋白的提取。采用堿提酸沉法提取枸杞蛋白，并采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)枸杞蛋白的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為枸杞蛋白的深加工及生物活性肽的制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

枸杞：購(gòu)自中國(guó)寧夏回族自治區(qū)中寧市，經(jīng)寧夏大學(xué)鑒定為茄科(Solanaceae)枸杞屬(Lycium)中寧枸杞。樣品購(gòu)回后，置于-18℃冷凍保存。試驗(yàn)前，將枸杞取出恢復(fù)室溫后待用。

試驗(yàn)藥品：氫氧化鈉、鹽酸均為分析純，天津市百世化工有限公司；去離子水為實(shí)驗(yàn)室自制。

儀器：101型電熱鼓風(fēng)干燥箱，北京科偉永興有限公司；DG120型四兩裝中藥材粉碎機(jī)，浙江省瑞安市春海藥材器械廠；FA2003N型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；DK-S26型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；TG16-WS型離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；BCD-303WTZM(E)型美的冰箱，合肥美的電冰箱有限公司；LGJ-10型真空冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 挑選完整無(wú)損的枸杞果，放入烘箱于60℃干燥24 h取出恢復(fù)至室溫，用中藥粉碎機(jī)粉碎，裝入密封袋中，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 蛋白的提取 稱量5.000 g枸杞粉放入錐形瓶中，按照一定液料比加入去離子水，均勻攪拌，使枸杞粉與水充分接觸混合。滴加2 mol/L的氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)pH到9。然后放入一定溫度的水浴鍋中水浴反應(yīng)一定時(shí)間，取出樣品，6 000 r/min離心10 min，取上清液。為更好地除掉枸杞渣，將上清液6 000 r/min離心10 min，最后將上清液倒入新的錐形瓶中。向錐形瓶中滴加7%鹽酸調(diào)節(jié)pH到4，常溫靜置一定時(shí)間，6 000 r/min離心10 min去掉上清液，獲得蛋白[16]。用少量(3 mL左右)去離子水溶解蛋白并轉(zhuǎn)移至稱量瓶中，冷凍干燥15 h，稱量，按照公式計(jì)算的枸杞蛋白得率(R)。

式中，m為提取后的蛋白質(zhì)量(g)；M為枸杞原料質(zhì)量(g)。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 單因素試驗(yàn) 根據(jù)堿提酸沉法的操作流程來(lái)設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)，通過(guò)控制和改變?cè)囼?yàn)的變量來(lái)探究最佳的提取條件，在水浴時(shí)間2 h，水浴溫度40℃，酸沉?xí)r間10 min條件下分別研究不同液料比(6 mL/g、8 mL/g、10 mL/g、12 mL/g、14 mL/g、16 mL/g和20 mL/g)對(duì)枸杞蛋白得率的影響。在最佳料液比的基礎(chǔ)上，水浴溫度40℃，酸沉?xí)r間10 min的條件下，分別研究不同水浴時(shí)間(1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h和3.5 h)對(duì)枸杞蛋白得率的影響。在最佳液料比，水浴時(shí)間的基礎(chǔ)上，酸沉?xí)r間10 min的條件下，分別研究不同水浴溫度(20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃和55℃)對(duì)枸杞蛋白得率的影響。在獲得最佳液料比、水浴時(shí)間和水浴溫度的條件下，分別研究不同酸沉?xí)r間(10 min、20 min、30 min、40 min和50 min)對(duì)枸杞蛋白得率的影響，3次重復(fù)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差(SD≤0.05)。

1.3.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選取液料比、水浴時(shí)間、水浴溫度為研究的因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，其因素水平見表1。各處理3次重復(fù)，結(jié)果以均值±SD表示。

表1 枸杞蛋白提取的正交試驗(yàn)因素及水平

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Origin8繪制折線趨勢(shì)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素對(duì)枸杞蛋白得率的影響

從圖1可知，不同液料比、水浴時(shí)間、水浴溫度及酸沉?xí)r間對(duì)枸杞蛋白得率的影響。

2.1.1 液料比 枸杞蛋白的得率隨著液料比的增大而增加，在液料比為12 mL/g時(shí)，枸杞蛋白的得率最高，為12.10 %，隨后呈下降趨勢(shì)，可能是因?yàn)槿芤簼舛认♂?，提取環(huán)境受到破壞，粒子間的接觸可能性下降，導(dǎo)致得率下降。故液料比宜為12 mL/g。

2.1.2 水浴時(shí)間 水浴前2 h枸杞蛋白充分的溶解到水中，2 h之后，長(zhǎng)期的堿性環(huán)境使枸杞蛋白的空間結(jié)構(gòu)被破壞，故枸杞蛋白的得率逐漸下降。因此，水浴時(shí)間宜為2 h。

2.1.3 水浴溫度 隨著水浴時(shí)間的延長(zhǎng)，枸杞蛋白的得率先產(chǎn)生浮動(dòng)，當(dāng)水浴溫度達(dá)到40℃后，得率最高，隨后便逐漸下降，可能是因?yàn)闇囟冗^(guò)高，維持蛋白空間結(jié)構(gòu)的化學(xué)鍵遭到破壞，從而造成得率的下降。因此，水浴溫度宜為40℃。

2.1.4 酸沉?xí)r間 酸沉10 min后得率最高，隨即趨于下降。之后得率一直上下浮動(dòng)，但均不理想，因此最佳酸沉?xí)r間為10 min。

2.2 枸杞蛋白的最佳提取工藝

從表2可知，各因素對(duì)枸杞蛋白得率的影響依次為A>C>B。最佳提取條件為A1B3C3，即液料比10 mL/g、水浴時(shí)間2.5 h、水浴溫度45 ℃。經(jīng)方差分析表明，水浴時(shí)間和水浴溫度對(duì)得率的影響不顯著(P≥ 0.05)，液料比對(duì)枸杞蛋白的得率具有極顯著影響(P≤0.01)。在最佳提取條件下，進(jìn)行5次試驗(yàn)，枸杞蛋白的得率為14.2 %。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，水浴時(shí)間和水浴溫度對(duì)枸杞蛋白得率的影響不顯著，液料比對(duì)枸杞蛋白的提取影響極顯著。枸杞蛋白的最佳提取條件為液料比10 mL/g、水浴時(shí)間2.5 h、水浴溫度45℃，該條件下的枸杞蛋白得率為14.2%。

于士婷等[17]采用蒸餾水常溫浸提枸杞蛋白，響應(yīng)面法優(yōu)化提取參數(shù)在pH為8.60，液料比18.83∶ 1(mL/g)，提取時(shí)間9.79 h條件下，枸杞蛋白的得率為7.69%。楊重暉等[18]采用響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)優(yōu)化黑枸杞蛋白提取條件，在pH為7，提取時(shí)間21 h，提取次數(shù)2次，液料比 17∶1(mL/g)條件下，其枸杞蛋白的得率為8.62%。試驗(yàn)采用堿提酸沉法提取枸杞蛋白，正交試驗(yàn)得率為14.2%，較于士婷等[17-18]的研究結(jié)果高5.58%～6.51%。因此經(jīng)過(guò)優(yōu)化，堿提酸沉法在一定程度上可提高枸杞蛋白的得率。