別嘌呤醇對慢性間歇性缺氧大鼠腎損傷的保護作用

杜 藝 梁 順 魏玉婷 柯劍婷 裴雪峰

1.中山大學附屬第五醫院腎內科，廣東珠海 519000；2.廣東省粵北人民醫院內分泌科，廣東韶關 512000

阻塞型睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS）是指在睡眠狀態下上氣道塌陷阻塞所致的呼吸反復暫?；虻屯猓橛泻粑袠猩窠浾{節因素障礙的疾病[1]。OSAHS是臨床常見疾病之一，中年人患病率為2%～4%，兒童為2%～4.8%[2]，同時OSAHS 是高血壓與冠心病等常見心腦血管疾病的重要致病因素[3]。慢性間歇性缺氧（chronic intermittent hypoxia，CIH）是造成OSAHS患者器官損害的機制之一[4]，近年來對OSAHS相關的腎損傷研究也愈來愈重視。既往對OSAHS的治療研究重點多集中在外科手術，近年來對于內科藥物的輔助治療也愈加深入。本研究通過模擬CIH 致腎損傷大鼠，采用別嘌呤醇（allopurinol，ALLO）對其進行干預，觀察ALLO 對CIH 大鼠腎臟損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

ALLO（上海信誼萬象藥業股份有限公司），蛋白濃度測定試劑盒（Thomo公司，美國），Western 及IP 裂解液、PMSF （南京建成生物工程研究所），β-actin抗體（Sigma公司，美國），黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）抗體（山羊多克隆抗體，Santa公司，美國），HRP-IgG（CST公司，美國），ECL 發光液（北京酷來搏科技有限公司）。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）Assay 試劑盒（南京建成生物工程研究所），ELISA 試劑盒（購于上海銘睿生物科技有限公司），慢性間歇性缺氧/再氧合動物艙（廣州市華粵儀器有限公司）。

1.2 建立動物模型

健康雄性Wistar 大鼠40只，8周齡，體重180～200 g，由中山大學實驗動物中心提供，飼養于我院實驗動物中心。所有大鼠適應性飼養3 d，自由飲水飲食，飼養環境溫度19～23℃，空氣濕度為50%～60%。采用隨機數字表法將其分為正常對照組（10只）、模型組（30只），模型組又隨機分為模型對照組、ALLO小劑量組、ALLO大劑量組，各10只。

在大鼠適應期后，ALLO分別按40 mg/（kg·d）、20 mg/（kg·d）溶于2 ml 生理鹽水攪拌均勻后灌胃；模型對照組生理鹽水同等劑量灌胃，同時開始CIH模型建立。建模方法：根據N2稀釋原理，循環充入N2和O2，每1個循環為9 min，4 min 充入N2，隨之5 min 充入O2，使箱內氧濃度在6%和21%切換；由測氧儀監測間歇性低氧艙中的氧濃度，調節氣體流量，使每1個循環間歇性低氧艙內的最低氧濃度達6%左右，持續45 s 左右，然后再逐漸恢復至21%。艙內N2和O2的轉換通過定時電磁轉換器完成，該循環每天重復8 h，共14 d，最終建立間歇性低氧大鼠模型[5-6]。每天上午8點至下午4點將模型組放置于間歇性缺氧艙內。在實驗過程中將整個實驗艙罩上黑布，模擬夜晚大鼠睡眠環境，實驗艙內及室內溫度20～25℃，濕度45%～55%；實驗結束后，所有大鼠均放置普通飼養籠中飼養且給予人工日光照射，模擬大鼠白天狀態，大鼠全天活動及飲食自由。對照組大鼠放置無蓋箱內常規飼養，不予任何處理。每天除實驗時間外，所有大鼠放置相同自然環境下生活和飼養。

1.3 標本獲取及檢測

1.3.1 血清標本獲取 造模且治療14 d后，所有大鼠尾靜脈采血，分離血清待測。ELISA 方法檢測血清血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），放射免疫法測定胱抑素C（cystatin C，Cys-C）。

1.3.2 腎組織標本獲取 10%水合氯醛麻醉大鼠，開腹暴露左右腎，行腎靜脈注射PBS 液洗至腎蒼白再將腎取出，取100 mg 腎皮質，加入1 ml 生理鹽水后研磨成10%的勻漿，3000 r/min，離心10 min，取上清液應用比色檢測試劑盒檢測DOD、MDA水平，具體試驗方法見產品說明書。

1.3.3 病理切片制作 4%多聚甲醛固定部分腎組織24 h后，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，制備4 μm石蠟切片。常規HE 染色，中性樹脂封片，光鏡顯微鏡（×400）下觀察分析腎臟組織病理變化。

1.3.4 Western blot 檢測XO表達 以蛋白提取液裂解組織30 min，BCA 法測定蛋白濃度，加5×Buffer蛋白上樣緩沖液煮沸10 min，使蛋白變性。各孔道上樣50 μg 10% SDS-PAGE 凝膠，恒壓電泳，后濕轉至PVDF 膜。5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗（XO 多克隆抗體1∶600），4℃孵育過夜，β-actin（1∶200）作為內參，TBST 洗膜3次。辣根過氧化物酶標記二抗（濃度1∶5000）室溫孵育1 h，TBST 洗膜3次，ECL 發光液暗室膠片曝光。以β-actin 為內參，Quantity One 4.6.2 圖像分析軟件采集分析結果，計算XO 與β-actin 灰度比值作為相對表達量。

1.4 統計學方法

采用SPSS 21.0 統計軟件分析處理數據，服從正態分布的計量資料用均數±標準差（±s）表示，正態分布且組間方差齊性采用方差分析，兩兩比較采用t 檢驗，采用Pearson 檢測進行相關性分析，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腎組織切片光鏡觀察

正常對照組腎小球、腎小管及腎小管間質未發現異常（圖1A）。模型對照組腎組織切片可見腎小球體積增大、系膜細胞和基質顯著增生，可見部分腎小球出現局灶性節段性硬化；腎小管局灶性片狀擴張，上皮細胞可見空泡樣變性（圖1B）。ALLO小劑量組、ALLO大劑量組的腎小球肥大較模型組明顯減輕，無腎小球硬化；上皮細胞空泡樣變性消失（圖1C、圖1D）。

圖1 腎組織切片光鏡圖（HE，400×）

2.2 各組血Cys-C、VEGF水平及腎組織SOD、MDA、XO水平表達的比較

模型對照組的血Cys-C、VEGF水平，腎組織MDA及XO表達水平高于正常對照組，腎組織SOD水平低于正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）；模型對照組的血Cys-C、VEGF水平高于ALLO組，腎組織MDA、XO表達水平高于ALLO組，腎組織SOD表達水平低于ALLO組（P＜0.01）；ALLO大劑量組的腎組織MDA水平低于模型對照組、ALLO小劑量組，SOD水平高于模型對照組及ALLO小劑量組（P＜0.05）。ALLO大劑量組與ALLO小劑量組的血Cys-C、VEGF水平及腎組織XO表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）（表1）。

表1 各組血Cys-C、VEGF水平、腎組織SOD、MDA水平、XO表達的比較（±s）

表1 各組血Cys-C、VEGF水平、腎組織SOD、MDA水平、XO表達的比較（±s）

與正常對照組比較，*P＜0.01；與模型對照組比較，#P＜0.01；與ALLO小劑量組比較，☆P＜0.05

組別 只數 Cys-C（pmol/L） VEGF（pg/ml） SOD（μmol/L） MDA（μmol/L） XO正常對照組模型對照組ALLO小劑量組ALLO大劑量組10 10 10 10 59.8±25.5 101.3±29.1*82.6±26.7*#73.9±25.4*#52.14±5.68 190.5±15.3*86.3±7.5*#81.2±8.4*#101.25±1.26 52.3±1.02*88.3±1.11*#111.5±1.34#☆5.09±1.24 33.6±5.32*21.5±3.32*#10.2±2.01*#☆0.29±0.09 0.92±0.12*0.52±0.19*#0.61±0.17*#

2.3 腎組織MDA水平與血VGEF 的相關性

Pearson分析結果顯示，腎組織MDA水平與血VGEF 有相關性（r=0.65，P＜0.05）。

3 討論

OSAHS 主要表現為睡眠中出現完全或不完全的上氣道阻塞或塌陷，導致短暫呼吸停止或明顯低通氣在睡眠過程中反復發生，進而引起夜間低氧血癥、二氧化碳潴留與睡眠結構片段化等，漸進性地對人體各臟器產生損害[7]，主要變現為高血壓病、高脂血癥、高胰島素抵抗、肥胖、糖耐量異常、視神經非動脈炎性病變、心肌梗死、心力衰竭、哮喘和腦梗死等[8]。國內外大量研究發現，OSAHS 通過CIH 導致交感神經的異常興奮、內皮功能的紊亂、氧化應激反應等引起腎臟功能損害[9]，集中表現為腎功能改變、蛋白尿、多尿以及小管功能受損等[10]。持續氣道正壓（continuous positive airway pressure，CPAP）即用面罩將持續的正壓氣流送入氣道，作為一種標準的無創治療方式，其仍然是OSAHS患者的首選，對患者的腎臟功能損傷也具有明顯的改善作用。但有關報道顯示，在CPAP治療過程中有一定比例的患者不能耐受、依存性差，舒適度不夠，而且費用較高，長期使用者僅占40%[11-12]。因此，對藥物減輕OSAHS 臟器功能損害的研究近年來就越來越受到重視。

ALLO 為XO 抑制劑，XO 在嘌呤新陳代謝中扮演重要角色，且是活性氧（reactive oxygen species，ROS）的主要內源性來源[13]，在缺氧狀態下其含量將會上升，從而引起氧化應激。ALLO 抑制XO 活性可以減少氧化應激，防止氧化應激引起的細胞損傷以及缺血性并發癥得到驗證。ALLO 能改善大動脈的順應性及內皮細胞功能，減輕動脈硬化而不依賴于尿酸的降低[14]。一項來自英國的觀察性研究顯示，ALLO 治療是改善慢性腎臟病患者動脈硬化的獨立決定因素，并且有效地降低了外周血壓、中心血壓[15]。在慢性心力衰竭持續性缺氧時有報道ALLO 可以緩解XO 蛋白表達和活性均上調，減輕心臟和血管的氧化應激[16]。Hirsch等[17]報道，心力衰竭患者靜脈輸入ALLO后高能磷酸鹽相對和絕對濃度均升高，增加了心力衰竭患者ATP的生成。ALLO 對慢性心力衰竭大鼠心功能的改善作用基于其在慢性心力衰竭持續性缺氧患者中的治療作用，本研究通過建立CIH 大鼠模型，觀察ALLO 處理后CIH 大鼠的氧化應激反應及腎功的變化、ALLO是否對OSAHS所致的CIH 狀態的血管內皮功能有益，以期對臨床OSAHS的藥物治療提供線索。

本實驗中，經過間歇性缺氧處理后，模型對照組的血CysC 水平及腎組織的HE 染色均顯示明確的腎臟受損，腎組織中SOD水平下降，MDA水平、XO表達上升，提示在CIH 下腎組織的氧化應激反應加重，XO 在缺氧狀態下其含量將會上升，XO表達加強產生ROS 可以使腎組織細胞發生脂質過氧化，產生毒性終產物MDA[18]，從而引起氧化應激，這與既往的研究結果（OSAHS患者體內存在氧化應激和抗氧化能力下降[19]引起腎臟組織的損傷）符合。本實驗中，模型對照組大鼠出現明顯的氧化應激反應伴腎損傷，同時有VEGF水平的上升。VEGF 是體內廣泛存在的一種調節性蛋白質，高度特異性地作用于血管內皮細胞可促進血管內皮細胞分裂、增殖、細胞質鈣聚集以及血管生成的作用，在肺、腎臟、肝臟、腦和脾臟中含量豐富[20]。在腎臟中，VEGF 主要表達在腎小球足細胞，遠曲小管和集合管也有少量表達在近曲小管[21]。缺血缺氧是VEGF表達水平升高的強烈誘導因素[22]，模型對照組大鼠明顯的VEGF 上升說明CIH時出現血管內皮的損傷，VEGF 與腎小球基底膜有高度的親和力，能使基底膜的通透性增加，并促進一氧化氮、內皮素的產生，從而改變腎臟的血流動力學，導致蛋白尿的產生，損害腎功能[23]。文獻證實，ALLO 這種抗氧化劑對中重度OSAHS患者內皮細胞損傷有改善的作用，與本實驗相符[24]，同時本實驗也發現MDA水平與VGEF 有相關性（r=0.65，P＜0.05）。

本實驗中，ALLO兩組大鼠給予不同劑量的ALLO 干預后與模型對照組比較，血VEGF水平減低，腎組織中SOD水平上升，MDA水平下降，XO 的表達減少進而腎損傷減輕。但ALLO大劑量組和ALLO小劑量組只在腎組織MDA、SOD水平方面有差異，在血VGEF水平和XO 的表達方面并未發現顯著性差異，提示ALLO 對CIH 大鼠的氧化應激有抑制作用，同時可以降低血VGEF水平，但增大別嘌醇的劑量對XO的表達、血VGEF水平并未發揮作用。

因此，ALLO 對CIH 大鼠的氧化應激反應有抑制作用且隨劑量的加大作用更加顯著，同時ALLO 對CIH 大鼠的血VGEF水平有抑制作用，ALLO 可以減輕CIH 大鼠的腎損傷，CIH 大鼠的腎損傷可能與氧化應激及VGEF 有關，ALLO 可以作為OSAHS 腎損傷治療藥物的一個選擇做進一步的研究。