淀粉顆粒外殼分離方法與其性質表征研究

楊 麒 黃峻榕 嚴 青 馬 蕓 方晨璐 縱 偉

(1.陜西科技大學食品與生物工程學院， 西安 710021； 2.鄭州輕工業大學食品與生物工程學院， 鄭州 450001)

0 引言

自然界淀粉主要由高等植物合成，可以被生物分解，從而提供生命過程中所需的能量[1]，對人類飲食和工業可再生原料具有重要意義。淀粉具有復雜的空間結構，可分為分子、小體、殼層和顆粒4個結構層次，每個層次都影響淀粉的性質和應用[2]。自然界中的淀粉以顆粒形式存在，如球形、橢球形、多面體等[3-4]；淀粉的殼層結構又稱生長環結構，是圍繞顆粒臍心交替排列的同心環狀空間結構[5]；淀粉的小體是殼層和顆粒結構的構筑單元，其直徑分布在10～500 nm之間[2]；淀粉分子包括直鏈和支鏈兩種，前者通過α-1、4糖苷鍵連接，后者通過α-1、4糖苷鍵和α-1、6糖苷鍵連接[6]。

淀粉顆粒在水中受熱會吸水膨脹，控制加熱條件可實現顆粒的有限膨脹。淀粉的外殼結構與內部結構組成不同，顆粒外層較內部結構更加緊密，在受到外力作用時更易于保持原有形貌，外殼對淀粉溶液的黏度貢獻更大[7]。直鏈淀粉主要集中在淀粉顆粒內部，隨著淀粉的膨脹會游離而出進入溶液[8]。目前，對淀粉殼層結構的研究較少。本課題組前期研究已證實淀粉具有外殼結構，并探索了觀察馬鈴薯原淀粉顆粒外殼的方法[9]。本文以薯類(紅薯、木薯)、豆類(豌豆、綠豆)、谷類(玉米、小麥)三大類原淀粉作為研究對象，探索不同種類淀粉顆粒外殼的分離方法，研究淀粉的微觀結構和宏觀性質。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

木薯淀粉、玉米淀粉、小麥淀粉購自上海禾煜貿易有限公司第一分公司；紅薯淀粉購自北京德眾嘉鑫經貿有限公司；綠豆淀粉購自西安香再來調味品廠；豌豆淀粉購自成都楊天食品有限公司；無水乙醇、冰乙酸(色譜純)購自天津市天力化學試劑有限公司；DMSO(二甲基亞砜)、NaNO3(色譜純)購自德國Merck公司。

TecMaster型快速黏度分析儀(RVA)，波通瑞華科學儀器(北京)有限公司；HITACHI S-4800型掃描電鏡，日本日立集團；LSM 800型激光共聚焦熒光顯微鏡，德國ZEISS公司；D/max×2200 PC型X-射線衍射儀，日本理學公司；Q2000型差示掃描量熱儀，美國TA公司；Mastersizer 2000型激光粒度儀，英國馬爾文公司；Series 1500 GPC型色譜泵，DAWN HELEOS型多角度激光光散射儀，Optilab Trex型示差折光檢測器，美國Wyatt科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1淀粉熱學特性測定

準確稱量3 mg原淀粉(干基)置于差示掃描量熱儀(DSC)專用樣品盤，使用微量進樣器加入蒸餾水，配制成30%的淀粉乳。壓盤后對其進行DSC分析。測定溫度范圍設定為10～100℃，升溫速率設定為10℃/min。得到淀粉樣品的差示掃描量熱儀曲線，分析得到淀粉發生相變糊化過程中的相關參數。

1.2.2淀粉糊化溫度測定

在專用測量杯中加入1.4 g原淀粉樣品(干基)，加入蒸餾水配制成質量分數為5%的28 g淀粉乳。采用預先設定的13 min RVA標準程序處理淀粉乳：最初10 s轉速為960 r/min，之后轉速保持160 r/min至實驗結束。初始溫度設定為50℃保持1 min，經3.7 min升高至95℃并保持2.5 min，再經3.8 min降至50℃并保持2 min。通過TCW 3軟件分析淀粉在糊化過程中的糊化溫度。

1.2.3淀粉顆粒外殼分離方法

分別將紅薯、木薯、綠豆、豌豆、玉米、小麥6種淀粉在乙酸溶液(pH值分別為1、1.5、2、2.5、3)配置成5%的淀粉乳，取28 g于RVA專用測量杯中，在設定RVA程序下進行處理。設定RVA程序：最初10 s轉速為960 r/min，之后實驗轉速保持160 r/min。實驗起始溫度為50℃保持1 min，然后經3.7 min升高到設定的最高溫度并保持2.5 min，然后經3.8 min降至30℃并保持2 min，整個過程歷時13 min。反應結束后，立即取出測量杯，并將淀粉糊移入8倍體積無水乙醇充分洗滌，靜置去上清液。再分別用50 mL無水乙醇清洗3次，將沉淀置于表面皿中，于40℃下鼓風干燥，得到處理后的淀粉樣品。通過光學顯微鏡觀察各個條件下淀粉顆粒的形貌，確定得到各淀粉相對完整外殼的條件。

1.2.4淀粉形貌觀察

(1)場發射電子掃描顯微鏡觀察

將雙面導電膠固定于掃描電鏡專用的載物臺后，取少量原淀粉和處理過的淀粉(干燥)樣品于導電膠，用吸耳球將樣品吹散使其均勻黏附于導電膠上，并吹去多余部分。真空噴金(珀金)后，將載物臺放入樣品室進行觀察并拍照。掃描電鏡電壓設置為3.0 kV，采用下探頭觀察。

(2)激光共聚焦顯微鏡觀察

通過激光共聚焦顯微鏡(CLSM)觀察處理前后淀粉的變化。淀粉的染色參照文獻[10]的方法并適當修改。取原淀粉樣品10 mg，外殼樣品3 mg(處理后的淀粉外殼較原淀粉蓬松，密度小)，加入15 μL 8-氨基芘基-1,3,6-三磺酸三鈉鹽(APTS，10 mmol/L)乙酸溶液和15 μL的氰基硼氫化鈉(1 mol/L)水溶液混合，恒溫水浴(30℃、15 h)。然后用1 mL溶劑反復清洗樣品，離心去上層，再將染色后的樣品懸浮于100 μL甘油/水混合溶液(體積比為1∶1)。取適量懸浮液樣品置于載玻片，加蓋玻片，試用激光共聚焦顯微鏡進行觀察。觀察條件：20×鏡頭，Ar/Kr氣體激光器，488 nm激光發射波長，500～600 nm波長接收范圍。

1.2.5直鏈淀粉含量測定

采用GB/T 15683—2008中的碘比色法，對處理前后原淀粉和淀粉外殼的直鏈淀粉含量進行測定[11]。

1.2.6粒徑測定

使用Mastersizer 2000型激光粒度儀測定原淀粉和外殼的粒度分布。將0.5%(以干基計)質量分數的6種淀粉乳經RVA程序處理，靜置后將下層外殼移入800 mL蒸餾水中，伴以2 250 r/min的攪拌；原淀粉中加入少許蒸餾水，分散后移入800 mL蒸餾水中。使用通用分析模式，其中顆粒折射率和吸收率分別為1.5和0.1，分散劑(水)的折射率為1.3，所有樣品測量的遮光度需大于10%。

1.2.7糊化程度測定

各稱取原淀粉樣品0.2 g(以干基計)于離心管中，分別加入10 mL乙酸溶液(pH值為1.5，7.1 mol/L)，于室溫(25℃)下平衡30 min。在各淀粉對應處理溫度下，加熱攪拌30 min后冷卻至室溫并離心15 min(4 000 r/min)。緩緩倒出上清液于量筒，計算下層凝膠體積，從而得到淀粉的膨脹體積。以在10 mL蒸餾水中95℃下測定的淀粉膨脹體積為最大膨脹體積，測定處理后樣品的膨脹體積與在蒸餾水條件下的比值來反映糊化程度。

1.2.8結晶性質測定

將處理前后的淀粉樣品均勻平鋪在X-射線衍射儀的樣品槽中，玻片壓平后放入樣品臺中進行測試。測定條件為：Cu-Kα射線，波長1.542 ?，石墨單色器，測定的管壓40 kV，管流40 mA，連續掃描，掃描速度4(°)/min，掃描范圍2θ為4°～60°，發散狹縫1°，防散射狹縫1°，接收狹縫0.3 mm，得出淀粉的X-射線衍射圖譜。參照文獻[12]計算相對結晶度的方法，得出淀粉樣品的相對結晶度。

1.2.9分子量測定

采用高效分子篩色譜(HPSEC)，聯用多角度激光散射分析儀(MALLS)和示差折光檢測器(RI)，對原淀粉和外殼的分子量進行測定。

樣品處理：在10 mg淀粉樣品中加入1 mL 90%二甲基亞砜(DMSO)，100℃溶解12 h，加3 mL無水乙醇，離心除上清液(12 000 r/min，10 min)。無水乙醇洗滌沉淀兩次，風干后加3 mL 0.1 mol/L NaNO3(含0.02% NaN3)，充分溶解樣品(121℃，加熱20 min)，離心(12 000 r/min，10 min)，取上清液100 μL上樣。樣品數據用ASTRA 6.1軟件分析。

2 結果與討論

2.1 淀粉的熱學特性與糊化溫度

圖1為各原淀粉的差示掃描量熱(DSC)測試圖。可以看到，6種淀粉的DSC曲線都表現出單峰且出峰位置和峰的面積不同，即各淀粉結晶熔融溫度及糊化吸收焓值不同。紅薯、木薯淀粉的DSC曲線相近，結晶熔融溫度均為64℃左右，但紅薯淀粉的吸熱峰更窄，表明其淀粉顆粒內部結晶程度的分布更集中；綠豆、豌豆淀粉的DSC曲線也相近，結晶熔融溫度在60℃左右，略低于豆類淀粉。在6種淀粉中，谷類淀粉中玉米淀粉的DSC曲線峰強最大，吸熱焓最大，且結晶熔融溫度最高(65℃)，表明其顆粒內部分子形成的雙螺旋結構更加緊密。從小麥淀粉的DSC曲線可以看出，其結晶熔融溫度最低(57℃)，這與其支鏈淀粉的短鏈(聚合度小于12)比例較高有關[13]。但小麥淀粉中含有兩種尺寸和結晶程度不同的顆粒[14]，因此吸熱峰較寬。

圖1 不同淀粉的差示掃描量熱曲線Fig.1 Differential scanning calorimeter curves of different starches

通過快速黏度分析儀(RVA)測得各個淀粉的糊化溫度分別為：紅薯74℃，木薯和綠豆72℃，豌豆71℃，玉米和小麥89℃。可以看出薯類和豆類的糊化溫度接近，在溫度超過70℃后這兩類淀粉的膨脹顆粒在外力的擠壓下開始出現大量破裂，淀粉分子充分分散到水中，表現為淀粉乳黏度的急劇上升。而谷類淀粉在接近90℃時，才達到承受極限開始破裂，遠高于薯類和豆類淀粉的糊化溫度。影響淀粉糊化溫度的因素很多，例如淀粉的種類、淀粉顆粒大小、淀粉的膨脹特性、淀粉直鏈/支鏈比例、淀粉的結晶結構和淀粉分子鏈長分布等。有研究表明淀粉顆粒越小，水分子進入顆粒內部所需的能量越大，因此小顆粒的小麥淀粉需要在較高溫度條件下才能開始糊化[14]。另外，淀粉的糊化溫度與其膨脹特性直接相關，越容易膨脹的淀粉顆粒在攪拌作用下越容易發生糊化。以上原因可以解釋玉米淀粉和小麥淀粉的RVA糊化溫度較高。

可以看出不同淀粉的糊化溫度高于結晶的熔融溫度，這是因為淀粉顆粒內部結晶開始分解時，顆粒整體還比較完整，沒有發生大范圍的破裂，不會立即造成體系黏度的上升。比較各類淀粉的RVA糊化溫度和DSC熔融溫度規律，可以發現淀粉的結晶融化溫度越高，顆粒內部結構的分子間結合力就越高，越有利于顆粒維持原有結構并抵抗外力，糊化溫度也就越高[15-18]。

對淀粉樣品的處理和淀粉外殼的分離需在充分的水條件下進行。相較于DSC，利用RVA可實現淀粉外殼的大量制備。基于此，后續實驗通過調整RVA的最高處理溫度，建立不同淀粉外殼的分離方法。

2.2 淀粉外殼分離方法

圖2為原淀粉和經乙酸處理后(pH值1.5，7.1 mol/L)的淀粉外殼掃描電鏡圖?？梢钥吹?，原淀粉顆粒(圖2a～2f)表現出橢球形和多面體形，表面光滑。綠豆、玉米淀粉表面存在微孔，其中綠豆淀粉表面的微孔數量較多。研究表明，大部分的A型谷物淀粉表面含有微孔結構，這些微孔會與顆粒內部的蛇形通道相連，直通顆粒內部[12]。這些淀粉顆粒的通道微觀結構，可能有助于淀粉與酶和化學試劑的反應。而在B型淀粉中，如馬鈴薯和高直鏈淀粉則很少觀察到這些結構。對于谷物淀粉來說，表面小孔的直徑一般為0.1 μm左右，內部通道的直徑為0.1～0.3 μm[19-20]。

圖2 原淀粉和淀粉外殼的掃描電鏡圖像Fig.2 Scanning electron microscope images of native starch and starch outer shells

圖2g～2l為在乙酸體系下，分別經最高溫度處理后分離得到的6種淀粉外殼的掃描電鏡圖。最高處理溫度分別為：紅薯79℃、木薯77℃、綠豆87℃、豌豆81℃、玉米89℃、小麥73℃。所有溫度均比自身原淀粉的結晶熔融溫度高13～27℃(DSC測定結果，表1)，表明淀粉顆粒內部的結構都已遭到分解和破壞。相比于糊化溫度，薯類和豆類淀粉處理溫度比自身在水體系下的糊化溫度高5～15℃，這是由于低pH值會抑制淀粉顆粒的膨脹[21-22]，此時需高于糊化溫度才能提供足夠能量使顆粒破裂。而小麥淀粉的處理溫度比自身糊化溫度低16℃，卻比結晶熔融溫度高16℃，可能與較高的直鏈淀粉含量、顆粒內部的分子鏈長分布以及較低的淀粉糊黏度有關。

表1 不同淀粉的DSC熔融溫度、RVA糊化溫度和處理溫度Tab.1 Melting temperature, gelatinization temperature and treatment temperature of different starches ℃

由圖2可以看出，處理后的6種淀粉顆粒都已破裂，能清晰地觀察到很薄的外殼結構，厚度都在1 μm以內，顆粒內部中空。這與之前報道的馬鈴薯淀粉外殼[9]相似(RVA不完全糊化處理，pH值1.5乙酸溶液)。同時，淀粉外殼的內部也很少有附著物，說明在處理過程中淀粉顆粒內部物質隨著糊化過程的進行幾乎全部游離到溶液中。乙酸會對淀粉的形貌造成影響，例如對小麥和玉米原淀粉的表面造成裂縫和斑點，使馬鈴薯淀粉和小麥淀粉顆粒表面變得不光滑[23-25]。

圖3 原淀粉和淀粉外殼的激光共聚焦顯微鏡圖像Fig.3 Confocallaser scanning microscope images of native starch and starch outer shells

所有淀粉的外殼結構還部分保留原淀粉的部分形貌，說明淀粉外殼在處理過程中可以更好地維持自身結構，與內部結構相比差異很大。外殼較內部具有更好的韌性，更加耐熱、耐酸和耐剪切。研究發現淀粉外殼的變形程度與淀粉的黏度呈正相關，也說明顆粒的內外結構不同[22]。在綠豆淀粉外殼和玉米淀粉外殼上看不到原淀粉上的小孔結構，表明在糊化膨脹過程中外殼上的分子排布也發生了變化。玉米淀粉的外殼結構更接近于原淀粉，在處理過程中遭到破壞較小，而其他5種淀粉的外殼破壞嚴重，說明玉米淀粉更適合作為加工淀粉外殼的原材料。

圖3為淀粉處理前后的激光共聚焦圖，可以在原淀粉(圖3a～3f)中明顯觀察到淀粉顆粒內部的中空結構、孔道結構和明暗交替的層狀結構。由于APTS可與淀粉分子的還原末端結合并在激光照射下發出綠色熒光[26]，所以在相同分子量的情況下，直鏈淀粉還原末端較支鏈淀粉還原末端更多，更易與APTS結合從而熒光強度更大。淀粉顆粒內部的層狀熒光分布表明直鏈淀粉和支鏈淀粉有規律地周期分布排列。文獻[27]對不同直鏈淀粉含量(質量分數3%、19%、42%)的玉米淀粉進行CLSM觀察(沸水浴，0.5～4 min，尼羅藍染色)，發現直鏈淀粉含量與顆粒內部環狀結構的分布無直接關系。

從淀粉外殼(圖3g～3l)染色圖中可以看到，處理后的淀粉外殼發生了有限膨脹，直徑為原淀粉顆粒的2～3倍；內部無熒光，且外殼的熒光強度遠低于原淀粉的熒光強度，表明在處理過程中淀粉顆粒內部分子溶出或被破壞，淀粉外殼的分子分布隨著顆粒膨脹變得松散或部分溶出。文獻[28]研究了高直鏈玉米淀粉在加熱過程(70%直鏈淀粉，100～140℃，30 min，APTS染色)中的顆粒形態變化，發現高直鏈玉米淀粉在達到120℃時才開始出現明顯膨脹，此時淀粉顆粒的中心結構開始破壞，在130℃加熱30 min后，其熒光強度逐漸減弱，暗區向外擴展，說明直鏈淀粉組分已被破壞或移位。

總之，在乙酸體系(pH值1.5、濃度7.1 mol/L)中，通過快速黏度分析儀設置最高處理溫度與糊化溫度差值為-16～15℃對淀粉進行處理(表1)，可以分別得到紅薯、木薯、綠豆、豌豆、玉米、小麥6種淀粉的外殼。在其他條件下均不能得到較為完整的外殼。

2.3 淀粉外殼的表征

表2為各淀粉外殼厚度、直鏈淀粉質量分數、粒徑、糊化程度、相對結晶度和分子量。可以發現不同淀粉的外殼厚度存在差異，6種淀粉的顆粒外殼厚度在50～470 nm之間，這些尺寸應比原淀粉的外殼尺寸偏大，因為在處理過程中淀粉外殼和淀粉顆粒都隨著糊化作用發生了不同程度的吸水膨脹。薯類和豆類淀粉的外殼厚度比較接近，在95～470 nm之間；玉米淀粉部分區域的顆粒外殼厚度較薄，僅50 nm左右；小麥淀粉的最薄外殼大于130 nm，可能與這種淀粉的處理溫度最低有關。淀粉顆粒不是均勻的大分子物質，對于同種淀粉來說，顆粒的粒徑分布具有一定范圍，因此處理后得到的淀粉外殼厚度具有差異。

淀粉外殼的直鏈淀粉含量低于原淀粉，推測支鏈淀粉的側鏈形成大量雙螺旋結構，相互緊密堆疊連接形成了能抵抗外力的外殼。適當控制糊化條件，可使淀粉顆粒逐漸膨脹，顆粒內部物質轉移到溶液中。由于淀粉外殼中含有大量支鏈淀粉，結構相對緊實，有助于保持原有的殼層形貌。文獻[29]對馬鈴薯原淀粉進行化學糊化處理(4 mol/L CaCl2，21℃)后測定殘存顆粒的直鏈淀粉含量，發現淀粉外部的直鏈淀粉含量高于淀粉內部。這與本實驗結果不同，可能是由于前者在高濃度的離子體系中處理淀粉時，顆粒內部的直鏈淀粉會隨著攪拌游離到溶液中，導致殘存顆粒中的直鏈淀粉含量偏低。

原淀粉的平均粒徑范圍為13.1～27.4 μm，其中豌豆淀粉平均粒徑最大，為27.4 μm，木薯淀粉平均粒徑最小，為13.1 μm，這與掃描電鏡觀察的結果相匹配。同時，也與文獻[30-31]的測試結果一致。

表2 不同淀粉外殼厚度、直鏈淀粉質量分數、粒徑、糊化程度、相對結晶度及分子量Tab.2 Shell thickness, amylose content, particle size, gelatinization degree, relative crystallinity and molecular weight of different starch and starch outer shells

圖4 淀粉處理前后的X-射線衍射圖譜Fig.4 X-ray diffraction patterns of starch before and after treatment

分析各類淀粉的X-射線結果(圖4)可以發現，薯類和谷類原淀粉在2θ為15.1°、17.2°、18.1°、23.1°附近出現明顯吸收峰，屬于明顯的A型晶體結構。而豆類淀粉在2θ為5.5°、15.1°、17.2°、18.1°、23.1°附近出現明顯吸收峰，屬于C型晶體結構。一些研究中的綠豆[32]、豌豆[33]、玉米[34]、小麥[35]淀粉的結晶類型與本文一致，但其他研究中[36-37]的紅薯、木薯淀粉為C型晶型，說明淀粉的晶型類別與淀粉種類，生長環境密切相關。薯類淀粉(紅薯和木薯)與谷類淀粉(玉米、小麥)同為A型結晶，說明淀粉顆粒內部的雙螺旋排列相似。

從表2看出，經乙酸處理后，淀粉的相對結晶度明顯降低，說明結晶結構發生了較大程度的變化，這與淀粉的糊化程度有關。6種淀粉外殼的糊化程度分布在19%～56%，相對結晶度分布在5%～34%。其中，玉米淀粉外殼的糊化程度最低，綠豆淀粉外殼的糊化程度最高，而二者的相對結晶度變化均最大(處理后下降了83%)，這可能是由于這兩種淀粉顆粒表面特有的微孔使結晶結構更易與水分子結合而遭到破壞。

對比淀粉外殼和原淀粉的相關性質，發現6種淀粉顆粒的外殼厚度(50～470 nm)與其淀粉粒徑(13.1～27.4 μm)、直鏈淀粉質量分數(23.3%～37.6%)以及相對結晶度(18%～49%)沒有明顯相關性。

6種原淀粉的淀粉分子量分布在3.8×107～2.4×108g/mol。其中綠豆淀粉的分子量最高。文獻[38-39]分別測定了豆類淀粉、薯類淀粉和玉米淀粉的分子量，前者發現薯類淀粉的分子量較大，而后者發現玉米淀粉的分子量最大，說明淀粉分子量同樣與種類和來源密切相關。

在淀粉外殼中，淀粉分子量分布在4.3×107～1.2×108g/mol之間。可以發現，除綠豆淀粉外，其他淀粉外殼的分子量明顯高于原淀粉，說明參與形成外殼的淀粉分子更大，具有更強的分子間作用力、內作用力和空間效應，使淀粉外殼更耐剪切，具有黏彈性。以上結果說明，低pH值會抑制淀粉顆粒的膨脹，可以通過控制溫度和pH值調節淀粉的糊化程度，實現淀粉顆粒外殼的分離。

2.4 討論

目前微米級的包膜材料非常少見。淀粉外殼這種微米級的天然包囊結構，具有天然高分子材料的大部分優點，且非常容易被生物體消化利用。它還具有自身獨特的生物特性：吸水易膨脹成網絡口袋結構，可通過收縮改變內部容積，易與其他淀粉顆粒黏連等。因此，淀粉外殼不僅能被用作食品功能成分的穩定劑和緩釋劑，而且仍有其他巨大的應用價值有待開發?？梢酝ㄟ^改變淀粉外殼內外層的親水性，使其具有自組裝特性。另外，由于純天然淀粉的熱塑性比較差，可通過引入其他基團對外殼改性，以實現不同的包材硬度需求，將來可用于生物傳感器、分子器件、高效催化材料和醫用生物材料等。

3 結束語

通過控制淀粉的糊化條件、降低體系的pH值和處理溫度，研究了6種原淀粉顆粒外殼的分離方法。結果顯示，在pH值為1.5的乙酸體系中，通過對淀粉進行不完全糊化處理，可以得到較完整的不同淀粉外殼，厚度為50～470 nm，淀粉外殼的分子量高于原淀粉(除綠豆淀粉外)。淀粉外殼相對結晶度顯著降低，但還保留原淀粉顆粒的部分形貌，淀粉表面的微孔可以加劇外殼結晶度的降低。淀粉外殼厚度與其淀粉粒徑、直鏈淀粉質量分數以及相對結晶度沒有明顯相關性。玉米淀粉的外殼結構相對完整，更適合用于微米級包膜材料。