電針對APP/PS1雙轉基因老年性癡呆模型小鼠認知能力及海馬NMDARs表達的影響＊

許安萍，王 鑫，韓 麗，李志剛

（1. 北京中醫藥大學針灸推拿學院 北京 100029；2. 首都醫科大學附屬北京中醫醫院 北京 100010；3. 北京中醫藥大學中醫學院 北京 100029）

老年性癡呆，又稱阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，臨床表現為學習和記憶功能不斷衰退，并可能伴有精神癥狀和行為障礙[1]，是最常見的癡呆類型。隨著社會老齡化的必然趨勢，AD 作為一種老年期常見病，其產生的沉重家庭負擔及嚴重社會問題日益突出，已經成為亟待解決的公共衛生問題之一[2]。

海馬區是學習、記憶等認知功能的重要結構基礎。谷氨酸是中樞內重要的興奮性神經遞質，其在興奮性突觸傳遞和突觸可塑性改變中發揮關鍵作用。突觸傳遞的可塑性變化是學習、記憶的神經生理基礎。而記憶加固依賴于N-甲基-D-天冬氨酸型谷氨酸受體(NMDARs)的協調活動[3-4]。研究[5-6]表明，NMDARs 通過介導鈣離子依賴性信號轉導機制，參與學習空間策略。然而，在AD 等與年齡相關的神經退行性疾病中，NMDARs 介導的功能通常被破壞[7,8]。研究[9-11]已證實電針具有改善學習記憶能力的作用，但其作用機制仍未完全闡釋，是否與督脈電針調節NMDARs 功能尚不明確。基于此，本研究以“通督啟神”理論為指導，選用百會穴(GV20)、印堂穴(GV29)及水溝穴(GV26)三個督脈穴位，通過Morris水迷宮實驗，觀察電針干預對小鼠認知能力的影響；聚焦NMDARs，應用蛋白質免疫印跡（Western blot）技術，探討電針治療對海馬N-甲基-D-天冬氨酸型谷氨酸受體NMDAR1及NMDAR2B的調節作用，旨在探討督脈電針在AD預防中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6 月齡 APP/PS1 雄性小鼠和 C57BL/6J 年齡、性別匹配小鼠購自于北京華阜康生物科技有限公司(實驗動物許可證號：SCXK(Jing)2014-0004)。小鼠體重為（28.0 ± 2.0）g，于北京中醫藥大學實驗動物中心單籠飼養，給予常規飲食。室溫保持在（24 ± 2）℃，濕度40%-60%。每天更換墊料和飲用水，保持鼠籠清潔和干燥。在實驗前適應性喂養7天。本實驗嚴格按照中華人民共和國衛生部醫學實驗動物的使用要求進行操作。

1.2 主要實驗儀器試劑

主要實驗儀器及試劑見表1。

1.3 動物分組與干預方法

16只APP/PS1小鼠采用隨機數字表法分為兩組：癡呆模型組和電針治療組，每組8 只。另外，8 只C57BL/6J小鼠為對照組。

根據以往研究結果，本實驗選取百會穴、水溝穴及印堂穴，定位方法參考《實驗動物腧穴標準》。電針治療組，利用自制鼠套固定后進行電針干預，隔日1次，連續治療4 周。具體穴位定位及操作方法見表2。對照組及癡呆模型組小鼠，以相同方法用自制鼠袋束縛20 min。

1.4 指標檢測

1.4.1 Morris 水迷宮

Morris水迷宮測試分為2個實驗，第1個實驗是定位航行實驗，于電針治療結束后第二天進行，持續4天。第2 個實驗是空間探索實驗，于定位航行實驗后進行。

定位航行實驗[12]：Morris 水迷宮劃分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4 個象限。正式實驗前1 天，保持動物在水池中自由游泳90 s，上午、下午各1 次，使其熟悉迷宮環境。正式實驗時，水池注水30 cm 深，滴加奶粉使水呈不透明，使用溫度計監測水溫并維持在（22±1）℃，保持實驗過程中室內光線強度一致。圓柱形平臺置于Ⅲ象限中央水面下2 cm。在Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ3 個象限各選距離水池圓心相等的點作為入水點，訓練時先將動物置于平臺上10 s，然后將動物面朝池壁輕輕放入水中，圖像采集系統記錄小鼠從入水至找到平臺的時間（即逃避潛伏期），小鼠在平臺上停留5 s視為上臺成功。若60 s內找不到平臺，逃避潛伏期記為60 s。每天Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ3 個象限各訓練2 次，以6 次潛伏期的算術均值作為這一天的成績進行統計分析。以此評價小鼠空間學習能力。

表1 主要實驗儀器試劑信息

空間探索實驗：定位航行實驗結束后，撤除平臺。然后分別在Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ象限的入水點放入小鼠，記錄小鼠在60 s內穿越原平臺所在位置的次數及在Ⅲ象限停留時間進行統計分析。以此評價小鼠空間記憶能力。

1.4.2 Western Blot 檢測

（1）樣本制備：Morris 水迷宮測試后 1 天，每組隨機選取6只小鼠麻醉后開顱取海馬，然后儲存在-80℃冰箱備用。

（2）Western blot 步驟：海馬組織蛋白抽提后，BCA法進行蛋白定量，以RIPA 調整蛋白濃度，加入5 ×還原樣品緩沖液后樣品終濃度：4 mg/ml。煮沸變性5 min。配制12%的分離膠，濃縮膠濃度為5%。20 μg/孔上樣，濃縮膠恒壓90 V，約20 min；分離膠恒壓160 V 300 mA 恒流，0.45 μm 孔徑 NC 膜，轉膜時間 1 h。將膜完全浸沒3% BSA-TBST 中室溫輕搖30 min 封閉后分別加入NMDAR1（1:1000）及NMDAR2B（1:2000）抗體，4℃孵育過夜。加入二抗（1:20000），洗膜后加入ECL，反應后膠片曝光顯影定影后掃描分析結果。β-actin作為內參蛋白。

表2 實驗穴位定位及操作方法

1.5 統計學分析

采用SPSS 20.0 軟件進行統計分析。實驗數據以均數 ± 標準差（）表示，Morris 水迷宮定位航行實驗中逃避潛伏期采用重復測量設計資料的多變量方差分析（Repeated measures two-way ANOVA）分析；Morris 水迷宮空間探索實驗及Western blot 結果采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）分析，組間采用最小顯著差異法（LSD）分析。P< 0.05 表示差異具有統計學意義，P<0.01表示差異具有顯著統計學意義。

2 結果

2.1 定位航行實驗結果

在Morris 水迷宮定位航行實驗中，空間學習能力通過小鼠爬上平臺躲避水的時間(逃避潛伏期)來評估。對照組及電針治療組的逃避潛伏期均隨著訓練有所減少，但癡呆模型組的逃避潛伏期無明顯變化，說明模型小鼠的學習能力下降（見圖1）；與第1 天相比，對照組在第3 天，電針治療組在第4 天，逃避潛伏期開始明顯縮短（P<0.01)（見圖2）。

2.2 空間探索實驗結果

在Morris 水迷宮空間探索實驗中，癡呆模型組小鼠在第Ⅲ象限目標平臺穿越次數及該象限停留時間均較對照組明顯減少(P<0.05)，說明模型小鼠的記憶能力受損；與癡呆模型組相比，電針治療組的穿越平臺次數及在Ⅲ象限停留時間均有所增加，但差異無統計學意義（見圖3-4）。

2.3 Western Blot結果

與對照組比較，癡呆模型組小鼠的海馬NMDAR1及NMDAR2B 表達水平明顯下降(P< 0.01)；與癡呆模型組相比，電針治療組的NMDAR1 及NMDAR2B 表達均有所增加(P<0.01)（見圖5-6）。

3 討論

根據中醫理論，“腦為元神之府”，AD 以認知障礙和記憶能力損害為主要表現，病位在腦。《素問·骨空論》中記載督脈“入絡腦”。督脈是臟腑氣血精氣上輸于腦的重要路徑，其功能正常，陽氣得以運行于周身，內化精微以養神明；若督脈為病，神無所統，則會導致神志相關病癥[13]。前期研究[14,15]表明，通調督脈可以調節β淀粉樣蛋白相關分泌酶及降解酶的水平，增加腦血流量，良性調節星形膠質細胞有關通路[16]，從而促進淀粉樣蛋白代謝，保護認知功能，改善記憶能力，達到治療AD的作用。

圖1 各組逃避潛伏期變化趨勢圖

圖2 各組逃避潛伏期組內比較

圖3 各組穿越平臺次數比較

圖4 各組Ⅲ象限停留時間比較

圖6 各組海馬NMDAR2B表達情況

AD 起病隱匿，早期癥狀輕微，典型的征象是記憶障礙，疾病中期患者認知障礙隨著病情進展逐漸出現，甚至出現空間定向障礙。學習與記憶兩者關系密切，學習是獲取新知識的過程，其結果是記憶。評估小鼠學習記憶能力的方法有多種，Morris 水迷宮實驗是目前公認有效的方法之一[17]。在定位航行實驗中，小鼠通過多次練習尋找水下固定的圓形平臺，從而獲得穩定的空間位置認知。結果顯示，癡呆模型組小鼠逃潛伏期均值高于對照組，并且通過4 天訓練無明顯變化。這一現象表明，APP/PS1 小鼠6 月齡學習記憶能力明顯下降，避水積極性下降。而電針治療組中，APP/PS1 小鼠的逃避潛伏期隨訓練逐漸下降，在第4天明顯縮短，提示電針對癡呆模型小鼠的學習能力有促進作用。在空間探測實驗中，模型組小鼠表現出對目標(平臺)無明顯傾向性的隨機搜索策略。這一策略表明小鼠的學習行為模式發生了改變，記憶能力明顯受損。而電針治療組平臺穿越次數、目標象限停留時間均有所增加，提示電針對癡呆模型小鼠記憶同樣具有保護作用。

谷氨酸是一種興奮性氨基酸，是中樞內重要的內源性興奮性氨基酸遞質，對神經元有極強的興奮作用。谷氨酸在中樞神經元間發揮的興奮性突觸傳遞作用主要通過NMDAR。中樞谷氨酸受體至少分為5種，研究[18]表明，NMDARs參與了海馬CA1區長時程增強（LTP）等突觸可塑性誘導及學習和記憶機制，是中樞神經系統學習和記憶等關鍵功能的基礎[19]。在認知能力減退為主要特征的疾病中，NMDARs的表達下降引起NMDAR依賴性的突觸可塑性降低[20]。NMDAR 存在多個亞單位，但功能性的 NMDAR 由 NMDAR1 和 NMDAR2 共同組成，NMDAR1和NMDAR2共表達可顯著增強通道活性。其中NMDAR1是發揮生物效應的必要結構蛋白。NMDAR與學習記憶密切相關，其中NMDAR2B與之最為密切[21]。本實驗結果表明，督脈電針促進癡呆模型組小鼠海馬NMDAR1及NMDAR2B的表達。

綜上所述，本研究重點在于督脈電針對癡呆模型小鼠海馬NMDARs的影響。實驗結果顯示電針治療組的學習記憶能力改善，并且NMDAR1及NMDAR2B的表達增加。因此，電針可能通過調整NMDARs介導的LTP，增強認知能力。這可能是電針治療癡呆的作用途徑之一[22-24]。值得注意的是，NMDARs還參與介導Ca2+/鈣調蛋白通路、NO 通路等多條信號轉導通路，然而各條信號通路并不是孤立的，而是彼此聯系，其在調節學習記憶的過程中可能存在其他潛在作用機制[25-26]。今后，本課題組將圍繞NMDARs進一步研究相關信號通路，深入探討電針保護學習和記憶等腦高級功能的機制。