基于輪廓分析的電針長強穴對FMR1基因敲除小鼠CREB表達的多腦區聯動效應研究＊

齊詩儀，張志燦，林 燊，章思佳，林麗莉，林 棟

（福建中醫藥大學針灸學院 福州 350122）

脆性X 綜合征（Fragile X syndrome，FXS）是脆性X智力低下基因(Fragile X mental retardation 1，FMR1)發生突變引起FMR1 mRNA 低表達或不表達，導致患兒出現中度或重度的智力障礙。目前FXS 尚無有效療法，產前診斷和選擇性流產是其主要的預防手段。因此，越來越多的研究者關注到了傳統針灸療法，其通過體表干預從而改善精神類疾病[1]?！峨y經·二十八難》云：“督脈者…上至風府，入屬于腦”。說明督脈與腦聯系密切，故有“病變在腦，首取督脈”之言。本課題組在前期臨床研究中通過針刺小兒腦性癱瘓伴智力低下患兒的督脈絡穴、初始之處—長強穴，發現其對改善患兒認知功能障礙具有顯著的療效[2]。同時，在前期動物實驗中，本課題組通過研究與FRX 患者具有相似特征，精神發育遲滯的重要動物模型FMR1 基因敲除小鼠[3-4]，發現針刺長強穴分別影響了海馬、皮質、小腦等不同腦區的相關蛋白表達量改變，從而改善突觸可塑性[5-7]。那么，針刺長強穴所引起的不同腦區間的整體效應又是如何？故本研究擬通過觀察FMR1基因敲除小鼠海馬、皮質、小腦的不同腦區之間環磷腺苷效應元件結合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)、磷酸化CREB(p-CREB）蛋白的表達情況，以進一步研究針刺的腦功能效應。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

將FMR1 基因敲除小鼠（美國The Jackson Laboratory 公司）進行配種與繁殖，并采用聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）檢測技術測定新生小鼠的基因表型，選擇純合子基因型小鼠進行實驗。小鼠飼養于福建中醫藥大學實驗動物中心SPF級房間（許可證號：SYXK（閩）2014-001）。實驗過程嚴格遵照科技部［2006］398 號《關于善待實驗動物的指導性意見》文件要求執行。

1.2 試劑與儀器

水合氯醛（福州邁新生技術開發有限公司）；華佗牌0.5寸針灸針（蘇州醫療用品廠有限公司）；HANS-200A韓氏穴位神經刺激儀（北京華運安特科技有限責任公司）等。

1.3 方法

1.3.1 PCR鑒定動物基因表型

對通過配種繁殖所得的48 日齡新生小鼠進行頜下靜脈叢采血。在血液樣品種加入Buffer TBP（血液樣品：Buffer∶TBP=1∶2），充分搖勻后離心去上清，加入TE Buffer 離心去上清數次。在沉淀物中加入Buffer Digestion 和Proteinase，震蕩混勻后進行56℃水浴1 h。樣品加入Buffer PR 混勻后放置-20℃冰箱20 min。隨后將樣品室溫離心取上清，在上清液中加異丙醇混勻后室溫靜置，后離心去上清。75%乙醇清洗后室溫離心去上清，重復兩次后室溫靜置10 min，加入TE Buffer并提取DNA。將提取的DNA 進行1%瓊脂糖電泳（150 V、100 mA 20 min）并于化學發光凝膠成像系統中拍照觀察。FMR1基因敲除小鼠可擴增出350 bp 的DNA片段，雜合子可擴增出350 bp和180 bp的DNA 片段，引物序列見表1。

1.3.2 動物分組與干預方法

將通過PCR 技術篩選出純合子基因敲除小鼠，隨機分成三個組，每組8 只。（1）空白組僅模擬抓取動作。（2）非經非穴組選擇肋弓最低點上1 cm 作為干預部位。（3）長強組根據《實驗針灸學》[8]小鼠長強穴位于尾根與肛門之間的凹陷中。其中非經非穴組與長強組使用自制雙極針，進針約10 mm，并連接韓式電針儀，連續波，強度2 mA，頻率2 Hz，干預20 min。各組每天于固定時間進行干預，一天一次，干預14 天。

1.3.3 免疫組織化學技術

（1）于干預結束當天采用水合氯醛對小鼠進行腹腔注射，麻醉后對其進行心臟灌注，隨后取出全腦進行固定。（2）依次進行不同濃度梯度酒精、二甲苯脫水、石蠟包埋。（3）將蠟塊切片、撈片和烘片。（4）將切片進行脫蠟、透明、水化后進行抗原修復。（5）使用純水沖洗切片三次后晾干，加入過氧化氫，室溫下孵育10 min。PBS 溶液沖洗三次，加入山羊血清，室溫下孵育 10 min。（6）去殘液加一抗，室溫下孵育 60 min。PBS溶液沖洗三次，加即用型快捷免疫組化試劑，室溫下孵育15 min。PBS 溶液沖洗三次，去殘液加LDAB顯色液，室溫下孵育5 min。顯微鏡觀察后用純水洗凈，蘇木素復染，PBS 沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，最后用中性樹膠封片。

1.4 統計學方法

本研究使用SPSS 22.0軟件分析軟件對數據進行分析，所得的數據以()表示，組間比較采用單因素方差分析及最小顯著差法（LSD-t），并對不同腦區的各指標變化采用輪廓分析，以P<0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 PCR基因鑒定結果

圖1泳道可見400 bp目的片段，為純合子小鼠，即FMR1 基因缺失。而雜合子小鼠泳道為350 bp 和180 bp，即FMR1基因存在。

2.2 免疫組化法檢測

在光鏡下標記細胞胞漿內充滿棕褐色的陽性反應顆粒，為圓形或橢圓形且體積較大。

2.2.1 CREB在不同腦區的表達變化

圖1 PCR基因鑒定結果

不同腦區CREB 表達平均光密度值提示（見圖2質的CREB 表達量較海馬（P<0.05，P<0.01）、小腦（P<0.05）顯著升高。

針對腦區與蛋白表達的交互作用分析，平行輪廓分析結果差異有統計學意義（F=5.094，P=0.002<0.01），表明各組CREB 表達在腦區變化輪廓不平行，即腦區的聯動變化不一致，由圖2 可知空白組在三個腦區的CREB 呈現出不同于非經非穴組、長強組的表達趨勢，即針刺組與非針刺組的在三個腦區之間行為模式不同。

2.2.2p-CREB在不同腦區的表達變化

圖2 各腦區CREB蛋白陽性目標平均光密度比較（左）及輪廓分析結果圖（右）

圖3 各組小鼠三個腦區抗體陽性目標平均光密度值比較（10X）

不同腦區p-CREB 表達平均光密度值提示（圖4和圖3）：空白組海馬的CREB 表達量較皮質（P<0.05）、小腦（P<0.001）顯著升高；非經非穴組與長強組在皮和圖5），空白組小腦的p-CREB 表達量較皮質（P<0.01）、海馬（P<0.05）顯著升高；非經非穴組小腦的p-CREB 表達量較海馬（P<0.01）顯著升高；長強組各腦區p-CREB表達量無顯著性差異（P＞0.05）。

針對腦區與蛋白表達的交互作用分析，平行輪廓分析結果差異無統計學意義（F=1.085，P=0.378＞0.05），表明各組p-CREB 表達的腦區變化輪廓相互平行—三組的腦區聯動變化一致；重合輪廓分析結果差異無統計學意義（F=1.880，P=0.177＞0.05），表明各組p-CREB的腦區變化輪廓重合—各組間腦區聯動變化程度一致；水平輪廓分析結果差異有統計學意義（F=9.870，P=0.001<0.05），表明各組p-CREB的腦區變化輪廓不水平—各組中三個腦區的蛋白表達不相等，其中小腦最高。

2.2.3p-CREB率在不同腦區的變化

圖4 各腦區p-CREB蛋白陽性目標平均光密度比較（左）及輪廓分析結果圖（右）

圖5 各組小鼠三個腦區抗體陽性目標平均光密度值比較（×10）

不同腦區p-CREB率提示（圖6），空白組與非經非穴組在小腦的p-CREB 率較皮質（P<0.001，P<0.01）、海馬（P<0.001，P<0.05）顯著升高；長強組在各腦區的p-CREB率無顯著性差異（P＞0.05）。

針對腦區與p-CREB 率的交互作用分析，平行輪廓分析結果差異無統計學意義（F=1.803，P=0.148＞0.05），表明各組p-CREB 率在腦區變化輪廓相互平行—三組的腦區聯動變化一致；重合輪廓分析結果差異無統計學意義（F=2.465，P=0.109＞0.05），表明p-CREB 率在三個腦區表達輪廓重合—各組間腦區p-CREB 率程度基本一致；水平輪廓分析結果差異有統計學意義（F=12.126，P<0.001），表明p-CREB 率在各腦區變化輪廓不水平—各組中三個腦區p-CREB 率不相等，其中小腦最高。

圖6 各腦區p-CREB率比較（左）及輪廓分析結果圖（右）

3 討論

3.1 長強穴針刺效應腦區的CREB表達特點

CREB 參與學習、長時程（Long-term potentiation，LTP）記憶的相關過程[9]，并介導了神經的保護作用，其在成癮、抑郁、焦慮等方面發揮著不可忽視的作用[10]。同時，CREB 被認為與早期海馬神經干的分化、存活和遷移有關[11]，其核蛋白作為細胞內酶信號級聯系統以及效應基因的反式激活系統的關鍵信號樞紐，故大多數神經元細胞內信號能激活CREB 使其磷酸化[12]，磷酸化的CREB以二聚體的形式與CRE目標基因序列結合[13]，通過調控神經營養因子的表達及其誘導的基因轉錄，從而在組織細胞修復、再生中起重要作用[14]。故在針灸的腦功能效應研究中CREB 逐漸成為關注的焦點。

3.1.1 皮質

額葉皮質作為認知功能的核心區域，有學者[15]發現其在算術與第二語言流利性的研究中激活明顯。而本課題組前期研究表明針刺長強穴上調FMR1基因敲除小鼠皮質腦源性神經營養因子（BDNF）、CREB 等相關蛋白表達[7]，并在淺針干預失眠患者的臨床研究中通過多元統計分析方法提取到了額顳枕區的特征腦電圖（EEG）信號[16]。

3.1.2 海馬

作為重要的信息處理區域的海馬，其與認知、情緒、行為、學習、記憶以及位置導航等功能密切相關[17]。故諸多研究者們在如抑郁癥等疾病研究中發現干預體表穴位能夠引起海馬區CREB的改變[18-19]，而本課題組在針刺FMR1基因敲除小鼠及端粒酶基因敲除小鼠的實驗研究中亦觀察到了海馬CREB 等相關蛋白表達量增加。

3.1.3 小腦

隨著生命科學的不斷發展，研究[14]表明小腦涉及了語言、時間感以及空間記憶等認知過程，因此越來越多的研究者們關注到了針刺對小腦及其與大腦之間關聯的影響。有學者[20]通過腦功能影像學觀察到針刺引起小腦的活動變化，這與本課題組前期通過分子生物學技術觀察針刺長強穴對FMR1基因敲除小鼠小腦的影響變化結果一致[6]。同時，本課題組采用多元統計分析方法觀察了針刺即刻與針刺后20 min小腦與扣帶回的影響[21]，其研究結果表明針刺增強p-CREB 蛋白表達，且該變化在小腦與扣帶回之間存在較為一致的時間變化規律。

有鑒于此，本研究通過采用多元統計分析手段對FRM1基因敲除小鼠皮質、海馬及小腦的CREB及其磷酸化蛋白進行研究，以揭示不同腦區之間針刺效應的變化特征。

3.2 針刺長強多腦區聯動效應的研究

組化結果顯示長強組與非經非穴組的皮質CREB表達量均較海馬與小腦高且差異具有統計學意義，而空白組海馬區的CREB 表達量較皮質與小腦高且差異具有統計學意義，同時其輪廓分析結果進一步說明了長強組、非經非穴組同空白組在三個腦區中CREB 蛋白表達變化趨勢不平行（圖4）。有學者[22]利用血氧水平依賴功能磁共振成像(BOLD-fMRI)觀察到在靜息狀態時大腦存在著較試驗狀態的高激活區域，該區域與海馬密切相關。這與本研究結果一致，在無干預狀態（空白組）fMR1 基因敲除小鼠海馬區CREB 表達量較其他腦區高。而針刺刺激（長強組、非經非穴組）引起腦區的活動狀態發生改變，形成以皮質為高激活區域，小腦相對增高，海馬相對降低的腦功能活動狀態。該結果亦與腦功能影像學研究結果相呼應：針刺穴位引起左側額上回、小腦扁桃體等區域的負激活[20]。也就是說，本研究結果提示CREB 蛋白的表達量改變與腦功能影像學結果相仿，其對針刺刺激做出了響應。然而效應不同于響應，產生響應不一定具有效應[23]，故而本團隊認為其可能作為響應蛋白與穴位效應并無較密切關系。

在p-CREB 及其磷酸化率的輪廓分析的結果顯示空白組、非經非穴組與長強組在三個腦區變化趨勢呈現重合而不水平，形成以小腦為高激活區域，海馬與皮質相對較低的腦功能活動狀態。方差分析結果進一步顯示其在空白組與非經非穴組呈現小腦較皮質和（或）海馬顯著升高，但其在長強組中三個腦區之間差異無統計學意義。初步表明三組中磷酸化蛋白及其變化率的腦區變化趨勢基本一致，且小腦可能參與了認知能力的加工處理過程，這與本課題組前期的針刺對小腦蛋白表達影響的結果一致[6]。同時，在腦區變化趨勢基本一致的前提下，在非穴位的組別中（即空白組與非經非穴組）磷酸化蛋白（率）差異具有統計學意義，而穴位組（長強組）差異則無統計學意義，這提示針刺長強可能出現穴位效應，并通過蛋白磷酸化而體現。

3.3 穴腦功能效應研究

近年來，針灸的腦功能效應中樞聯動機制研究逐漸成為了穴腦功能研究的熱點（圖7）。諸多研究者通過腦功能影像學技術探索針刺的腦功能中發現“功能連接(Functional connectivity)”現象[24]，即針灸作用于體表穴位產生療效并非由單一腦區完成，而是由多個腦區協同調節共同發揮作用[25]。同時，越來越多學者關注到了“大腦-小腦環路”是小腦參與認知的基礎[26-27]，其動態交互作用與短時空間記憶關系密切[28-29]。然而，通過檢測腦區之間血氧水平依賴從而判定時域相關性的腦功能影像學僅能提示針刺刺激體表的響應腦區。同時，目前大多數采用分子生物學技術探索針灸穴腦效應的研究多采用某一較有限的局部指標，如某蛋白的表達、某遞質的水平等，以及采用較為單一的方差分析以探尋效應機制的差異中特定蛋白或基因的特異性響應，或衡量針灸方案取得的效果，而缺乏對腦功能整體性效應的分析。

故為進一步對針刺腦功能效應的時空變化特征進行表述，本課題組前期研究采用了[16,21]多元統計分析方法對研究數據進行了提取與分析（圖8），從時間、空間等多維度、多角度對穴腦效應進行探索[30]。本研究通過采用輪廓分析對海馬、皮質、小腦不同腦區之間的行為模式改變進行了分析，并呈現其直觀的可視化結果。本課題組將該腦區間的行為模式改變稱之為多腦區聯動效應，即將空間、時間等因素作為研究參數，在針刺作用的某個（某幾個）時刻，不同腦區之間的激活模式及其累積效應的呈現。不同于腦功能影像學顯示多個腦區響應模式—即“有（無）”的“點亮”行為；腦功能聯動效應則涵蓋了針刺效應“量”在不同腦區中的程度變化，凸顯了針刺后腦區之間的相對變化特征。同時，本研究采用大腦發育程度較成熟的48日齡小鼠，故其存在著對外界刺激更高的反應狀態，擁有更強的腦區聯動效應。

本研究通過采用輪廓分析的方法對不同腦區之間的行為模式聯動改變進行了分析，并呈現其直觀的可視化結果。本研究結果初步表明針刺刺激可能通過影響CREB 表達使得fMR1 基因敲除小鼠形成以皮質為高激活區域的腦功能活動狀態。而針刺長強穴則引起p-CREB 表達量在三個腦區中特異性改變，提示其可能存在穴位效應。未來，本團隊計劃通過多元統計分析方法對疾病、時間、空間等因素展開多角度、多維度的分析，以期豐富針灸的腦功能效應中樞聯動機制研究。

圖7 穴腦功能效應研究框架及潛在策略

圖8 腦區聯動效應示意圖