基于AHP-CRITIC法結合正交設計優選復方血竭跌打膏中四味中藥提取工藝＊

俞越童，鄒慧琴，姚月保，楊瑞琦，崔述生，閆永紅＊＊

（1. 北京中醫藥大學中藥學院 北京 102488；2. 北京市鼓樓中醫醫院 北京 100009）

復方血竭跌打膏為北京市鼓樓中醫醫院國家名老中醫崔述生教授用于治療急性軟組織損傷的經驗方。復方由續斷、延胡索、紅花等中藥組成，具有化瘀止痛、舒筋通絡的功效，該方（原名為崔氏速效損傷靈藥膏）曾于1993 年獲北京市科技進步獎，已在臨床使用二十余年，療效確切。由于原院內制劑為復方內全部中藥飲片粉碎成細粉后直接加蜂蜜攪拌而成的糊劑，外觀粗糙，使用、儲存不便，限制了其在臨床的推廣應用。因此，本課題組擬將復方血竭跌打膏開發為乳膏劑。

藥材提取工藝的選擇直接影響復方中藥療效的發揮。經現代藥學文獻研究，并結合處方藥味化學性質和常用入藥方式，本研究擬對復方血竭跌打膏中續斷、延胡索、紅花、骨碎補4味藥材合提，將其提取液濃縮后以流浸膏入藥。復方血竭跌打膏中續斷辛溫破散，甘溫補益，既能活血化瘀，又能強筋壯骨[1]。其中，三萜皂苷類成分為續斷的主要活性成分[2]。藥理學研究表明續斷具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗病毒、增強免疫、神經保護、促進骨折愈合等作用[3-5]。延胡索具有活血散瘀、理氣止痛的功效，主要含有生物堿類化學成分，其中延胡索乙素作為其質量控制的重要指標，止痛效果最強[6-8]。紅花是傳統的活血化瘀、祛瘀止痛的良藥，其中是醌式查耳酮碳苷與黃酮類化合物為主要功效物質[9-10]。藥理學研究表明，羥基紅花黃色素A具有抗炎、抗腫瘤、抗血栓等多種活性，為紅花的質量控制指標[11-12]；骨碎補補腎強骨，行血脈，續筋骨，其中主要活性成分為柚皮苷，具有抗炎、促進骨折愈合、抗骨質疏松等作用[13-14]。

因此，本研究采用正交試驗設計，以川續斷皂苷Ⅵ、延胡索乙素、羥基紅花黃色素A、柚皮苷的含量和出膏率為考察指標，用AHP-CRITIC 混合加權法計算5 項指標的權重系數，并對正交試驗數據結果進行綜合評分，考察提取溶劑、料液比、提取時間、提取次數對提取效果的影響，優選出處方中續斷、延胡索、紅花、骨碎補的最佳合提工藝，為本復方下一步應用劑型的改進、質量標準的完善等提供實驗依據。

1 儀器材料

1.1 儀器

本研究所用的主要儀器包括：Waters e2695 Alliance 高效液相色譜儀（2998 PDA 檢測器）；FW-100高速萬能粉碎機型（北京科偉永興儀器有限公司）；HH-S6A 電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；電風鼓吹干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；BSA124S電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司。）

1.2 藥材與試劑

本研究所用的藥材與試劑包括：續斷（批號：1801006）、延胡索（批號：1806003）、骨碎補（批號：1806001）、紅花（批號：1805004）飲片均購于安國市聚藥堂藥業有限公司，經北京中醫藥大學閆永紅教授鑒定，均符合2015 版《中華人民共和國藥典》規定；對照品延胡索乙素（批號：5066，質量分數≥98.0%）、川續斷皂苷Ⅵ（批號：5688，質量分數≥98.0%）、羥基紅花黃色素A（批號：4261，質量分數≥98.0%）、柚皮苷（批號：5562，質量分數≥96.0%）均購于上海詩丹德標準技術服務有限公司；甲醇、乙腈為色譜純，賽默飛世爾科技有限公司；水為娃哈哈純凈水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 吸液率考察

稱取處方量續斷、延胡索、紅花、骨碎補藥材飲片共26 g，加入1 000 mL水，測定藥材全部潤透時的吸液率。結果測得藥材吸液率為212%。因此，第一次提取時多加2倍量溶劑。

2.2 供試品溶液制備

按處方比例稱取續斷、延胡索、骨碎補、紅花共26 g，回流提取2 次，第一次加10 倍量50%乙醇，第二次加8 倍量50%乙醇，每次提取1 h，濾過，合并提取液，用50%乙醇定容至500 mL，搖勻，過0.22 μm的微孔濾膜，即得。

2.3 含量測定方法的建立

2.3.1 色譜條件

川續斷皂苷Ⅵ和柚皮苷的檢測條件：色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18column（4.6×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水，梯度洗脫：0～15 min，23%～30%乙腈；15～35 min，30%～40%乙腈；檢測波長：280 nm（柚皮苷），212 nm（川續斷皂苷Ⅵ）；進樣量：10 μL；柱溫：30℃，流速：1.0 mL·min-1。

羥基紅花黃色素A 的檢測條件：流動相：乙腈-0.1%磷酸水；梯度洗脫：0～20 min，12%～20%乙腈；檢測波長：403 nm；進樣量：10 μL；柱溫：30℃；流速：1.0 mL·min-1。

延胡索乙素的檢測條件：流動相：乙腈-0.005%三乙胺水溶液；梯度洗脫：0～30 min，20%～70%乙腈；檢測波長：280 nm；進樣量：10 μL；柱溫：30℃；流速：1.0 mL·min-1。

2.3.2 對照品母液的制備

分別取川續斷皂苷Ⅵ、柚皮苷對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解配置成濃度為730 μg/mL 的川續斷皂苷Ⅵ、358 μg/mL的柚皮苷混合對照品母液。

取羥基紅花黃色素A 對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解配置成濃度為1 127 μg/mL 的羥基紅花黃色素A對照品母液。

取延胡索乙素對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解配置成濃度為418 μg/mL 的延胡索乙素對照品母液。

2.3.3 陰性樣品溶液制備

按處方比例分別稱取缺續斷、缺骨碎補、缺紅花、缺延胡索的其余三味藥材，用50%乙醇回流提取2次，第一次加10倍量溶劑，第二次加8倍量溶劑，每次1 h，合并2 次提取液，用50%乙醇定容至500 mL，搖勻，過0.22 μm的微孔濾膜，即得。

2.3.4 專屬性考察

按照“2.1”“2.3.2”“2.3.3”項下方法，分別制備供試品溶液、對照品母液、陰性續斷樣品溶液、陰性骨碎補樣品溶液、陰性紅花樣品溶液和陰性延胡索樣品溶液，按照“2.3.1”項下色譜條件分別進樣測定。結果顯示，19 min左右，供試品溶液和川續斷皂苷Ⅵ對照品溶液均出現川續斷皂苷Ⅵ的特征吸收峰，而陰性續斷樣品溶液在此處無色譜峰；6 min 左右，供試品溶液和柚皮苷對照品溶液均出現柚皮苷特征吸收峰，而陰性骨碎補樣品溶液在此處無色譜峰；8 min 左右，供試品溶液和羥基紅花黃色素A 對照品溶液均出現特征吸收峰，而陰性紅花樣品溶液在此處無色譜法，表明此方法專屬性良好；23.6 min 左右，供試品溶液和延胡索乙素對照品溶液均出現延胡索乙素特征吸收峰，而陰性延胡索樣品溶液在此處無吸收峰；表明此方法專屬性良好。HPLC色譜圖見圖1～4。

2.3.5 線性關系考察

圖1 供試品溶液（A）、混合對照品溶液（B）和陰性續斷樣品溶液（C）的HPLC圖（212 nm）

圖2 供試品溶液（D）、混合對照品溶液（E）和陰性骨碎補樣品溶液（F）的HPLC色譜圖（280 nm）

分別精密量取一定量對照品母液，制備成系列不同濃度的川續斷皂苷Ⅵ、柚皮苷、羥基紅花黃色素A、延胡索乙素對照品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄對照品峰面積。以對照品溶液濃度（x）和峰面積（y）進行線性回歸，得到各成分回歸方程：川續斷皂苷Ⅵ：y=1992.2x-22183（r=0.9997），柚皮苷：y=15683x-18363（r= 0.9998），羥基紅花黃色素 A：y=26994x-361867（r=0.9995），延胡索乙素：y=9332.8x-11191（r= 0.9998）。研究結果表明：川續斷皂苷Ⅵ在73～730 μg/mL 范圍內濃度與峰面積呈良好的線性關系；柚皮苷在35.8～358 μg/mL 范圍內濃度與峰面積面積呈良好的線性關系；羥基紅花黃色素A 在56.35～1 127 μg/mL 范圍內濃度與峰面積呈良好的線性關系；延胡索乙素在4.18～418 μg/mL 范圍內，濃度與峰面積呈良好的線性關系。

2.3.6 精密度試驗

圖3 供試品溶液（G）、羥基紅花黃色素A對照品溶液（H）和陰性紅花樣品溶液（I）（403 nm）

分別取一定濃度的川續斷皂苷Ⅵ、柚皮苷、羥基紅花黃色素A、延胡索乙素對照品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件連續進樣6 次，測定各指標成分峰面積。結果，川續斷皂苷Ⅵ、柚皮苷、羥基紅花黃色素A、延胡索乙素峰面積的RSD 值分別為0.95%、0.56%、0.72%、1.26%，表明實驗儀器精密度良好。

2.3.7 重復性試驗

按照“2.1”項下制備6 份供試品溶液，分別進樣測定各指標成分的峰面積。結果川續斷皂苷Ⅵ、柚皮苷、羥基紅花黃色素A、延胡索乙素峰面積的RSD值分別為1.55%、1.65%、0.85%、1.86%，表明此方法重復性良好。

2.3.8 穩定性試驗

圖4 供試品溶液（J）、延胡索乙素對照品溶液（K）和延胡索陰性樣品溶液（L）的HPLC圖（280 nm）

取供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h 進樣，測定各指標成分的峰面積。結果川續斷皂苷Ⅵ、柚皮苷、羥基紅花黃色素A、延胡索乙素峰面積的RSD值分別為0.68%、1.98%、0.86%、1.12%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.4 出膏率測定

精密吸取供試品溶液20.0 mL，置已干燥恒重的蒸發皿中，水浴蒸干，于105℃烘箱中干燥3 h，取出，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質量，計算出膏率（計算公式：出膏率＝干膏質量(g)/藥材總質量(g)×100%）[15]。

2.5 提取溶劑考察

按處方比例稱取延胡索、續斷、骨碎補、紅花26 g，6 份，分別用水、10%、30%、50%、70%、90%的乙醇回流提取兩次，第一次加10 倍量溶劑，第二次加8 倍量溶劑，每次提取1 h，濾過，合并提取液，用相應體積提取溶劑定容至500 mL，搖勻，過0.22 μm 的微孔濾膜，即得。表1為提取溶劑考察結果表。

由表1 可知，4 種指標成分的含量和出膏率在用50%和70%乙醇提取時相對較高，因此，選擇50%、60%、70%作為提取溶劑的三水平進行正交試驗。

2.6 正交試驗設計

綜合提取溶劑考察結果、預實驗結果，并考慮實際生產，固定提取次數為2次，選擇對提取效果影響較大的三個因素：乙醇濃度、料液比、提取時間為考察因素，進行L9(34)正交設計。由于吸液率考察結果為212%，因此，在第一次提取時多加2 倍量提取溶劑。表2為因素水平表，表3為正交試驗結果表。

表1 提取溶劑考察結果

表2 因素水平表

2.7 指標權重的確立

2.7.1 AHP法計算權重系數[16-17]

AHP 法是一種解決多目標復雜問題的定性與定量相結合的決策分析方法。該方法將定量分析與定性分析結合起來，用決策者的經驗判斷各衡量目標能否實現的標準之間的相對重要程度，并合理地給出每個決策方案的各個標準的權數，利用權數求出各方案的優劣次序。本實驗依據復方血竭跌打膏中各藥味君臣佐使配伍原則和藥味占比大小，將5 項考察指標量化分為5 個層次，各指標重要性由強到弱依次為川續斷皂苷Ⅵ＞延胡索乙素＞羥基紅花黃色素A＞柚皮苷＞出膏率，構造5 個指標兩兩比較判斷矩陣。表4為兩兩比較判斷矩陣。

由表4 兩兩比較判斷矩陣計算得出川續斷皂苷Ⅵ、延胡索乙素、羥基紅花黃色素A、柚皮苷、出膏率的權 重 系 數 分 別 為 0.4185、0.2625、0.1599、0.0973、0.0618，并進行了一致性檢驗，結果一致性比率（CR）＝0.0152＜0.10，表明通過AHP 法求得的各指標權重系數一致可靠。

2.7.2 CRITIC法計算權重[17]

CRITIC 法是以評價指標間的對比強度和沖突性為基礎來確定指標客觀權數的客觀賦權法。

評價指標的對比強度用標準差（δj）表示，指標的標準差越大，其所蘊含的信息量越大；沖突性是以指標之間的相關系數為基礎，第j 個指標與其他指標的沖突性量化指標為，其中rij為評價指標 i和j之間的相關系數。用cj表示第j個指標所包含的信息量，計算公式為為同一指標的評價數量），cj越大表明第j個指標所包含的信息量越大，相對重要性也越大。第j 個指標的客觀權重用ωj表示，計算公式為

表3 正交試驗結果

表4 兩兩比較判斷矩陣

將表3 中5 項考察指標的正交試驗數據進行無量綱化處理，5 項指標均為越大越優型，采用公式：yij-[xij-(xij)min]/[(xij)max-(xij)min]，然后計算相應的對比強度（δj）、沖突性（fj）、信息量（cj）、指標權重（ωj）。結果，用CRITIC 法計算出川續斷皂苷Ⅵ、延胡索乙素、羥基紅花黃色素A、柚皮苷、出膏率5 項指標的權重系數分別為：0.3004、0.1459、0.1602、0.1314、0.2621。表 5 為相關計算數據。

2.7.3 AHP-CRITIC混合加權法計算權重[18]

AHP 法求得的權重系數體現決策者的主觀經驗，CRITIC 法考慮到樣本數據存在的客觀信息，將兩者相結合，兼顧主客觀因素，AHP-CRITIC 混合加權法綜合權重計算公式為：ω綜合ij＝ωAHPijωCRITICij/∑ωAHPijωCRITICij。計算得到川續斷皂苷Ⅵ、延胡索乙素、羥基紅花黃色素A、柚皮苷、干膏率5 項指標的綜合權重系數分別為0.5750、0.1752、0.1172、0.0585、0.0741。

2.7.4 綜合評分結果比較

本研究采用 AHP 法、CRITIC 法及 AHP-CRITIC 混合加權法計算求得的權重系數分別對實驗結果進行綜合評分。對3 組綜合評分進行相關性分析，結果CRITIC 法與 AHP 法的相關系數為 0.878，CRITIC 法與混合加權法的相關系數為0.875，AHP 法與混合加權法的相關系數為0.995，三者相關性顯著（P＜0.01），說明通過AHP法、CRITIC 法及AHP-CRITIC 混合加權法得到的綜合評分結果具備一致性。對3種方法求得的權重系數進行相關性分析，結果AHP 法與CRITIC 法的相關系數為0.425，兩者相關性不顯著（P＞0.05），說明所反映的信息不具疊加性。表6 為3 種賦權法綜合評分結果。

2.7.5 數據處理與分析

對AHP-CRITIC混合加權法求得的綜合評分進行直觀分析和方差分析。表7 為直觀分析結果，表8 為方差分析結果。

由表7 直觀分析可知，各因素對崔氏速效損傷靈復方提取工藝的影響從大到小依次是：B＞A＞C，即溶劑用量＞乙醇濃度＞提取時間。方差分析結果表明，溶劑用量對提取工藝具有顯著影響（P＞0.05），而乙醇濃度和提取時間無顯著影響。結合實際生產，選擇最佳工藝為：A3B3C2，即用10 倍量70%的乙醇回流提取2次，每次1.5 h。

表5 CRITIC法相關計算數據

表6 3種賦權法綜合評分結果

表7 直觀分析結果

表8 方差分析結果

3 提取工藝驗證

稱取處方量的續斷、延胡索、骨碎補、紅花藥材3份，按優選出的最佳提取工藝條件重復3次，測定各指標，并進行綜合評分，結果見表9。

由表9 可知，川續斷皂苷Ⅵ的平均含量為3.4591%，RSD 為0.77%；延胡索乙素的平均含量為0.0861%，RSD 為0.64%；羥基紅花黃色素A 的平均含量為1.4690%，RSD 為1.70%；柚皮苷的平均含量為0.9429%，RSD 為1.18%；平均出膏率為29.1955%，RSD為0.52%；綜合評分均值為98.86，RSD 為0.65%，表明優選出的提取工藝穩定可行，可用于復方血竭跌打膏的實際提取生產。

表9 工藝驗證結果

4 討論

4.1 評價指標的選擇

根據文獻報道及2015版《中華人民共和國藥典》成方制劑記載，續斷、骨碎補在復方制劑中提取工藝有水提，也有醇提，延胡索多采用醇提，紅花多采用水提[19-21]，因此，本研究考察水和不同濃度的乙醇對四味藥材提取效果的綜合影響，選擇合適的提取溶劑。川續斷皂苷Ⅵ、延胡索乙素、羥基紅花黃色素A、柚皮苷分別為續斷、延胡索、紅花、骨碎補的主要有效成分，也是《中華人民共和國藥典》規定的含量測定成分，出膏率為中藥復方提取工藝研究的常用指標。因此，本研究以4種成分的含量和出膏率作為評價指標，多指標成分綜合評價更能體現中藥復方的整體性、復雜性和有效性。

4.2 權重系數的確定方法

采用多指標綜合加權評分法時，各指標權重系數的賦予是綜合評分是否科學合理的關鍵[22]。層次分析法（AHP）是一種可將決策者的經驗予以量化，將定性和定量相結合，并對決策對象進行優劣排序、篩選的多目標決策分析方法。但個人主觀因素對整個過程的影響很大，計算過程較粗糙，會忽略了實際樣本數據的信息。CRITIC 法適用于確定指標客觀權重，能體現客觀數據信息。本實驗通過加權求和的方式，將AHP法和CRITIC法相結合，兼顧主客觀因素，得到指標的綜合評分，使得綜合評價更具有科學性、客觀性和準確性。