雀腦藥材的質量標準提升研究＊

段秀俊，劉 培，楊 超，張 娜，閉梅森，段青青，樸晉華

（1. 山西中醫藥大學中藥與食品工程學院 榆次 030619；2. 上海中醫藥大學中藥學院 上海 201203；3. 山西省食品藥品檢驗所 太原 030006）

雀腦為文鳥科動物麻雀（Passer montanus saturatus Stejneger）的新鮮腦組織經加工炮制而成，始載于《名醫別錄》，并且《本草綱目》《食療本草》《動物本草》《滇南本草》《現代養生保健中藥辭典》《中國動物志》《中國動物藥志》《中藥大辭典》《肉禽蛋奶養生》《中華本草》等均有記載[1-8]。雀腦味甘，性平，歸腎經，具有補腎興陽，潤膚生肌的作用，主治腎虛陽痿，耳聾，聤耳，凍瘡等[8]。《儒門事親》曰：“臘月雀腦子，燒灰研細，小油調，涂凍瘡口上”，記載了雀腦治療凍瘡的功效；宋朝趙信《圣濟總錄》載：“取鮮雀腦如粟粒大，將耳道清洗干凈，直接將雀腦置于耳內，外以藥棉塞。每日換藥1 次，換藥時要清洗耳道，否則會有臭味，7日為1 療程”，記載了雀腦治療耳聾的功效。中醫認為，腎生骨髓，髓又充腦，故雀腦當有補腎之作用，故《滇南本草》謂本品：“入腎興陽澀精”。可見其以治腎與腦之虛證為主功效，對手足皸裂、凍瘡等癥可外涂患處；腎虛則應內服之。現代研究認為，雀腦含維生素B1、B2、煙酸、維生素C、膽固醇及鈣、磷、鐵等礦物質[6]。

雀腦在國內屬冷背藥材，多民間習用，目前只有山西廣譽遠國藥有限公司養生國寶龜齡集將其作為組成藥味入成方制劑，且只有《山西省中藥材標準》1987 版附錄簡單收載該品種的來源與制法[9]。為規范山西省地方用藥，提高山西省地方用藥標準，山西省食品藥品監督管理局于2011 年啟動地方標準修訂工作時，將雀腦列為首批研究品種之一。本課題組對雀腦的來源、名稱、別名、動物形態、采收加工、性味歸經、功能主治、用法用法等的歷代古文獻記載情況進行了系統梳理，并對其化學成分、藥理作用、毒理等現代的研究報道進行了分析，更對其質量標準相關內容進行了較為系統的研究，重點包括鑒別、檢查、含量測定，這也是首次對該藥材進行質量控制研究，具體內容如下。

1 儀器和材料

1.1 儀器

日立L-8900 氨基酸自動分析儀（HITACHI NO.852-0062）；FB223 自動內校電子分析天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；DHG-9075A 型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科技有限公司）；FA2140型電子分析天平（上海精密科學儀器有限公司）；KQ3200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BX53正置熒光顯微鏡（Olympus Corporation,Japan）；SX2-4-10 馬弗爐（爐南電爐烘箱廠，上海亞明熱處理設備有限公司）；KDN-04C凱氏定氮儀（浙江托普儀器有限公司）；AUW120D 電子天平（島津）；SHB 循環水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；SY-2000 旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；HH-2 數顯恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司），ZNHW-II 智能恒溫電熱套（鞏義市予華儀器有限責任公司），5 mL 容量瓶，10 mL 容量瓶，25 mL 容量瓶，50 mL 容量瓶，50 mL 圓底燒瓶，100 mL 圓底燒瓶，量筒，試管夾，球形冷凝管，鐵架臺，橡膠管，鐵夾，雙頂絲，移液管，吸耳球，膠頭滴管，燒杯。

1.2 材料

丙氨酸對照品（中國藥品生物制品檢定院，含量測定用，批號：140680-201002）；氨基酸混合物對照品（日本Wako 公司，批號：KPP5222，每種氨基酸濃度為2.5 μmol·mL-1，含天門冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、精氨酸等17 種常規蛋白水解液層析純氨基酸）；茚三酮溶液（批號KQF6365）、茚三酮緩沖液（批號KQF6365）；流動相溶液[PH-1（批號 A5259H1）、PH-2（批號A5259H2）、PH-3（批 號 A5259H3）、PH-4（批 號A5259H4）、PH-RG（批號A5259HRG）]為色譜純（日本Wako 公司）；水為娃哈哈純凈水；其余試劑均為分析純。雀腦3批（因麻雀屬于國家二級保護動物，故實驗只研究了3 批藥材，廣譽遠提供了2 批，自己收購麻雀取腦1批），經山西中醫藥大學裴香萍副教授鑒定為文鳥科動物麻雀的新鮮腦組織。

2 方法與結果

2.1 鑒別

2.1.1 性狀鑒別

本品為淺黃棕色的粉末及碎片；氣腥，味淡，生雀腦為深黃褐色粉末；氣腥，味淡（見圖1）。

2.1.2 顯微鑒別

實驗于400 倍顯微鏡下觀察到樹突碎節，長者形如樹杈狀分叉,短者為短圓柱體形，橫斷面類圓形。于1 000 倍油鏡下，觀察到分叉狀明顯的樹突碎節外，且觀察到神經纖維、其髄鞘及神經膜呈鞘狀分節段包裹在軸突周圍，形似藕節，其間斷部位，軸膜裸露，俗稱郎飛結（見圖2）。

2.1.3 薄層鑒別

取本品粉末0.2 g，加70%乙醇5 mL，超聲處理15 min，濾過，濾液作為供試品溶液。另隨機取20111001 批雀腦藥材作為對照藥材，同法制備對照藥材溶液。再取丙氨酸對照品，加70%乙醇制成每1 mL含0.5 mg 的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（《中華人民共和國藥典》2015年版四部0502薄層色譜法）試驗，吸取供試品溶液及對照藥材溶液各2 μL、對照品溶液1 μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（3∶1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%茚三酮丙酮溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點（見圖3）。

圖1 雀腦性狀特征

圖2 雀腦顯微特征

2.2 檢查

2.2.1 水分

根據《中華人民共和國藥典》2015 年版四部0832水分測定法之第二法（烘干法）進行檢查，3 批雀腦的測定結果見表1，水分介于5.57%-5.83%之間。

2.2.2 總灰分

根據《中華人民共和國藥典》2015 年版四部2302灰分測定法之總灰分測定法進行檢查。3批雀腦的總灰分測定結果見表2，總灰分介于4.40%-4.70%之間。

圖3 雀腦薄層色譜圖

表1 雀腦水分測定結果（n=2）

2.2.3 酸不溶性灰分

根據《中華人民共和國藥典》2015 年版四部2302灰分測定法之酸不溶性灰分測定法進行檢查。3批雀腦的酸不溶性灰分的測定結果見表3，酸不溶性總灰分介于0.28%-0.38%之間。

2.3 含量測定

2.3.1 總氮量

根據《中華人民共和國藥典》2015 年版四部0704氮測定法之第三法定氮儀進行檢查。3 批雀腦的總氮量測定結果見表4，總氮量介于6.49%-7.04%之間。

2.3.2 17種氨基酸的測定

2.3.2.1 色譜條件[10-21]

分離柱：離子交換樹脂2622 柱（4.6 mm×60 mm）；反應柱：離子交換樹脂2619 柱（4.6 mm×60 mm）；除氨柱：離子交換樹脂2650 柱（4.6 mm×40 mm）；流動相：分兩部分 B1-B6 和 R1-R3，B1-B4 分別為 PH1、PH2、PH3、PH4的檸檬酸鈉緩沖液，B5為純水，B6為PH-RG，R1-R3分別為茚三酮溶液、茚三酮緩沖液，洗脫程序見表5；柱溫：分離柱57℃，反應柱135℃；流速：分離柱0.400 mL·min-1，反應柱0.350 mL·min-1；檢測波長：440 nm及570 nm；進樣量20 μL。此條件下，各氨基酸的分離度良好（見圖4）。

表2 雀腦總灰分測定結果（n=2）

表3 雀腦酸不溶性灰分測定結果（n=2）

表4 雀腦總氮量測定結果（n=2）

2.3.2.2 氨基酸對照品溶液的配制

精密吸取40 μL 的氨基酸混合物標準品母液，用0.02 mol·L-1鹽酸溶液定容到 1 000 μL，混勻，做為對照品溶液（濃度0.1 nmol·μL-1）。

2.3.2.3 供試品溶液的制備

取雀腦藥粉（過5 號篩）約0.04 g，精密稱定，置25 mL 水解管中，加入 6 mol·L-1鹽酸溶液 10 mL，氮氣保護下封管，110 ℃水解24 h。取出，冷卻，濾過，精密吸取水解液 5 mL 于 25 mL 容量瓶中，用 6 mol·L-1氫氧化鈉溶液調pH 至7.0，純水定容至刻度。再精密吸取2.5 mL于5 mL容量瓶中，用0.02 mol·L-1鹽酸溶液定容至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過。

2.3.2.4 線性關系考察

精密吸取“2.3.2.2”項下對照品溶液80 μL，加入920 μL濃度為0.02 mol·L-1的鹽酸溶液混勻，按2倍稀釋的方法配制濃度分別為 0.2 μmol·mL-1、0.1 μmol·mL-1、0.05 μmol·mL-1、0.025 μmol·mL-1、0.0125 μmol·mL-1的混合對照品溶液。分別吸取上述各溶液20 μL，注入氨基酸分析儀，測定17 種氨基酸的峰面積值，以對照品濃度為橫坐標，峰面積值為縱坐標，分別進行線性回歸，17 種氨基酸的回歸方程及相關系數結果見表6。17 種氨基酸在 0.0125-0.2 μmol·mL-1范圍內均呈良好的線性關系。

表5 梯度洗脫程序

圖4 雀腦氨基酸測定色譜圖

2.3.2.5 精密度實驗

吸取濃度為0.1 μmol/mL 的氨基酸混合標準溶液20 μL，注入氨基酸自動分析儀，連續重復進樣6次，分別測定17種氨基酸的峰面積并計算各自RSD值，結果見表6，表明該方法精密度良好。

2.3.2.6 穩定性實驗

取同一供試品溶液（20111001 批），分別于0、2、4、6、8、10 h 注入氨基酸分析儀，依法測定17 種氨基酸的峰面積值并計算各自RSD 值，結果見表6，表明供試品溶液在10 h內穩定性良好。

2.3.2.7 重復性實驗

取 20111001 批雀腦藥材 6 份，每份約 0.04 g，精密稱定，分別按2.3.2.3 項下方法制備供試品溶液，按2.3.2.1 項下色譜條件測定，計算17 種氨基酸的含量并計算其RSD 值，結果見表6，表明該方法重復性良好。

2.3.2.8 加樣回收率試驗

取已測知17 種氨基酸含量的20111001 批雀腦藥材6份，每份約0.02 g，分別精密稱定，根據所測氨基酸濃度各加入適量的混合對照品溶液，按“2.3.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.2.1”項下色譜條件測定，計算17 種氨基酸回收率，結果見表6，17 種氨基酸的回歸率介于97.38%-102.19%，相對標準偏差（RSD）介于1.24%-2.47%，表明該方法準確性良好。

2.3.2.9 樣品含量測定

取3 批雀腦藥材，每批2 份，每份約0.04 g，分別精密稱定，按2.3.2.3 項下方法制備供試品溶液，2.3.2.1 項下色譜條件測定，計算17 種氨基酸含量，結果見表7。

表6 方法學考察試驗結果

表7 氨基酸含量測定結果（n=2）

3 討論

雀腦作為一味補益腎陽，潤膚生肌作用明顯的傳統中藥，目前尚無關于其有效質量控制研究的文獻記載及相關報道，本研究遵循中藥材質量標準制訂的規范要求，重點對質量標準研究的關鍵內容鑒別、檢查、含量測定進行報道，對于制訂該藥材的質量標準具有明顯的參考價值，對于規范該藥材的采收加工、市場流通、臨床用藥及涉及的相應制劑的質量控制具有積極意義。

雀腦為動物的神經組織，以神經細胞與神經膠質細胞為主，但由于新鮮雀腦含水量可達75%，干燥后組織基本破碎，顯微鏡下難以觀察到完整的細胞結構，而目前又未有關于動物干燥腦組織的顯微鑒別報道，經與組胚學及病理學專家研討，并參考人體解剖學對神經系統特征的描述，實驗最終找到了雀腦的特征顯微組織，即破碎樹突與神經纖維碎節，這也是首次對動物干燥腦組織的顯微特征進行研究與報道，為以后此類動物藥的顯微鑒別提供了實驗參考，也為動物特定組織的藥用部位顯微鑒別提供了思路。

實驗曾選擇多種氨基酸為對照，研究雀腦的薄層鑒別行為，結果以丙氨酸斑點最為清晰，且重現性好，故選定丙氨酸為對照品。同時，實驗對薄層鑒別的重現性和耐用性進行了研究，考察了雀腦在兩個廠牌（青島海洋化工廠與煙臺市江友硅膠開發有限公司之芝罘黃務硅膠開發實驗廠）的硅膠G 預制板及自制硅膠G 板上的薄層層析行為，并考察了雀腦在三個不同展開系統[正丁醇-冰醋酸-水（3∶1∶1）、正丁醇-冰醋酸-水（4∶1∶1）、正丁醇-冰醋酸-水（8∶3∶1）]下的薄層層析行為，結果雀腦藥材均主斑點清晰。這也是雀腦藥材的首次薄層鑒別研究報道。

文獻記載，雀腦藥用部位均為腦髓，應包括腦組織與髓，但實際藥用只用腦而不用髓，故項目組將雀腦的用藥部位規范為腦組織，同時，將文獻記載的采收加工中的腦殼規范為顱骨。本課題組的實驗首次采用一測多評法對藥材中的17 種氨基酸進行了定量分析，實驗結果顯示不同批次雀腦中17種氨基酸含量各不相同，且總氨基酸含量及必需氨基酸含量也差異較大，提示雀腦藥材的氨基酸含量受采收季節、雀齡、地區等的影響較為明顯。