響應(yīng)面法優(yōu)化蕎麥芽黃酮的提取工藝及其抗氧化性和穩(wěn)定性的研究＊

劉 宏，夏慧敏，李 娜，劉 悅，王煥蕓

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 呼和浩特 010110）

蕎麥，為蓼科蕎麥屬（Fagopyrum esculentum Moench）植物，研究[1]顯示，蕎麥不僅富含蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)及維生素、碳水化合物等常規(guī)營養(yǎng)素，而且含有黃酮類、甾體類、萜類、木脂素類、雙糖苷類、蕎麥糖醇類、蕎麥素類、蒽醌類、生物堿和有機酸及酯等多種具有多樣生物活性物質(zhì)，尤其是含有豐富的其他糧食作物所沒有的黃酮化合物，因而具有很高的營養(yǎng)價值和藥用價值，是優(yōu)良的藥食兼用作物。黃酮是一類重要的天然活性物質(zhì)，具有止咳，平喘，祛痰，消炎，抗菌及降血糖等作用[2]，對肥胖癥、糖尿病和心血管病有一定的療效[3]，開發(fā)黃酮及相關(guān)產(chǎn)品具有較高的醫(yī)療保健價值。隨著生活水平的提高，人們越來越注重生活質(zhì)量，蕎麥為原料加工的各種食品越來越受到人們的青睞。但目前對蕎麥芽的研究及產(chǎn)品開發(fā)只限于初步階段，目前的開發(fā)的產(chǎn)品種類較多，如蕎麥茶、蕎麥醋、蕎麥啤酒、蕎麥飲料以及蕎麥花蜜等[4]，但多為初級加工產(chǎn)品，對于蕎麥所含各種活性物質(zhì)，如黃酮、色素、多糖、多肽保健功能的差異化利用、及各活性物質(zhì)的功能沒有得到充分的發(fā)揮，產(chǎn)品附加值較低，經(jīng)濟效益也不高。更多有價值的深入研究有待開發(fā)，生產(chǎn)蕎麥芽可增加蕎麥的附加值，改變蕎麥以初加工產(chǎn)品為主的現(xiàn)象。

蕎麥黃酮作為蕎麥特有的生物活性物質(zhì)，具有較高的研究開發(fā)價值，如果通過適宜的技術(shù)手段將蕎麥黃酮提取加工并制成富含蕎麥黃酮的保健產(chǎn)品，不僅可以大大提高蕎麥黃酮的保健功效，同時也可為農(nóng)民增收致富、企業(yè)增效，通過形成蕎麥種植加工產(chǎn)業(yè)鏈帶動地方經(jīng)濟發(fā)展。

但是，蕎麥種子本身蕎麥[5]黃酮含量并不高，直接用來提取黃酮成本較高。研究發(fā)現(xiàn)，蕎麥種子經(jīng)萌芽后生物類黃酮含量大幅增加，峰值含量可達(dá)種子的數(shù)十倍，但黃酮在蕎麥中的含量并不是保持長期穩(wěn)定，而是隨著蕎麥芽的生長周期呈現(xiàn)先增長后遞減的拋物線形變化。本課題組前期對蕎麥萌發(fā)過程中黃酮的對累積變化規(guī)律進(jìn)行研究，研究表明蕎麥種子在萌發(fā)第12 天時黃酮累積量最高，相較種子含量為29.72 mg·g-1，發(fā)芽至第 12 天時，含量可達(dá)峰值的479.90 mg·g-1，具備了很好的開發(fā)利用的物質(zhì)基礎(chǔ)。目前，有關(guān)蕎麥萌芽與黃酮富集的研究較少，且僅局限于對富集情況以及不同營養(yǎng)條件下黃酮富集的變化[6]，對以蕎麥芽為原料進(jìn)行深加工的開發(fā)研究尚屬空白。因此，本課題組擬以此作為研究內(nèi)容，系統(tǒng)研究蕎麥芽黃酮累積規(guī)律以及以蕎麥芽為原料的黃酮提取工藝研究，并對蕎麥芽提取黃酮的穩(wěn)定性及抗氧化活性加以研究，為蕎麥黃酮深加工的開發(fā)研究奠定基礎(chǔ)。

目前蕎麥黃酮提取工藝多采用正交試驗設(shè)計，而采用響應(yīng)面實驗的報道較少。響應(yīng)面分析法采用多元二次回歸，將多因素指標(biāo)的相互關(guān)系用多項式近似擬合，通過對函數(shù)響應(yīng)面和等高線分析，能夠精確研究各因子與響應(yīng)值關(guān)系[7]。本實驗以蕎麥芽為實驗原料，以黃酮吸光度值為指標(biāo)，響應(yīng)面法優(yōu)化黃酮提取工藝，并通過研究蕎麥芽黃酮的穩(wěn)定性和抗氧化性，為蕎麥芽黃酮大規(guī)模生產(chǎn)和開發(fā)利用提供理論依據(jù)[8]。

1 材料

1.1 儀器

SUV-9100 型紫外分光光度儀（北京瑞利公司），DZKW-5-4 電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司），YLD-2000 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司），WK-1000A 小型高速粉碎機(灘坊市北方制藥設(shè)備制造有限公司)，調(diào)溫型電熱套（北京科偉永興儀器有限公司），SC-3614 低速離心機(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)，AL204 型萬分之一電子天平(梅特勒－托利多儀器有限公司)。

1.2 試藥

蕎麥種子，由內(nèi)蒙古清谷新禾有機食品集團有限公司提供；無水乙醇（天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠，分析純）；實驗用水為蒸餾水。

2 方法

2.1 對照品溶液的配制

取蘆丁對照品，精密稱定，置10 mL 容量瓶，用甲醇溶解，定容，制得含量為0.318 mg·mL-1的對照品溶液[9]。

2.2 供試品溶液的配制

取種植12 天的蕎麥芽，干燥，研細(xì)，過60 目篩，稱取 1.0 g，精密稱定，置 100 mL 圓底燒瓶中，按 1∶20 的比例加入65%乙醇，60℃提取1 h，抽濾，濾液轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶，加65%乙醇稀釋至刻度,搖勻，即得。

2.3 樣品黃酮含量的測定

分別取對照品溶液和供試品溶液1 mL，置10 mL量瓶，加 0.3 mL 5% NaNO2溶液，搖勻，放置 6 min 后，加 10%A1(N03)3溶液0.3 mL，搖勻，放置 6 min 后，再加入4%Na0H 溶液2 mL，搖勻，用50%乙醇定容，搖勻，放置30 min，在513 nm處分別測定吸光度。

2.4 響應(yīng)面分析法優(yōu)化蕎麥芽黃酮提取工藝

運用Design Expert 8.0 進(jìn)行3 因素 3 水平 Box-Behnken 試驗設(shè)計，以提取百分濃度、固液比、提取時間為考察因素，以吸光度為響應(yīng)變量，進(jìn)行響應(yīng)面法實驗設(shè)計，篩選最佳提取條件，因素及水平見表1，實驗安排見表2。

2.5 蕎麥芽黃酮的穩(wěn)定性研究

2.5.1 pH 值對黃酮穩(wěn)定性的影響

取 0.1 mol·L-1的 HCl 溶液和 0.1 mol·L-1的 NaOH溶液，配制成蕎麥芽黃酮濃度為0.02%的7 種不同pH值溶液(pH 分別為2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0，14.0)，室溫放置5 h，觀察溶液顏色變化，分別在1、2、3、4、5 h時測定 513 nm 處吸光度[10]。

表1 蕎麥芽黃酮提取單因素實驗安排表

表2 響應(yīng)面試驗因素與水平表

2.5.2 金屬離子對黃酮穩(wěn)定性的影響

分別配制 0.01 mol·L-1NaCl，KCl，CaSO4，AlCl3，CuSO4,CrCl3，CdSO4，F(xiàn)eCl3，Pb(NO3)3溶液，各取5 mL，分別加入5 mg·mL-1蕎麥芽黃酮溶液5 mL，充分搖勻，室溫放置5 h，測定513 nm 處吸光度[11]。

2.5.3 光照對黃酮穩(wěn)定性的影響

取濃度為5 mg·mL-1蕎麥芽黃酮水溶液兩份，分別放置日光燈和紫外燈下50 cm 處室溫照射48h，測定 513 nm 處吸光度[12]。

2.5.4 溫度對黃酮穩(wěn)定性的影響

取濃度為5mg·mL-1蕎麥芽黃酮水溶液4 份，分別于 30℃，50℃，70℃和90℃條件下加熱，冷卻后測定513 nm 處吸光度[13]。

2.5.5 氧化劑和還原劑對黃酮穩(wěn)定性的影響

取濃度為5 mg·mL-1蕎麥芽黃酮水溶液5 份，每份5 mL，分別加入10%H2O20.4 mL，0.8 mL，1.2 mL，1.6 mL，2.0 mL，用65%乙醇溶液定容至10 mL，室溫放置，定時測定513 nm 處吸光度[14]。另取濃度為5 mg·mL-1黃酮水溶液5 份，每份5 mL，分別加入10%NaHSO30.4 mL，0.8 mL，1.2 mL，1.6 mL，2.0 mL，用65%乙醇溶液定容至10 mL，室溫放置，定時測定513 nm 處吸光度。以上各試驗數(shù)據(jù)為三次重復(fù)，取平均值。

2.6 蕎麥芽苗黃酮抗氧化性能

2.6.1 有機自由基DPPH·清除能力的測定

稱取39.44 mg DPPH，用65%乙醇溶液定容至500 mL 容量瓶中，得到 0.2 mol/L DPPH 溶液；分別稱取0.05 g 的蕎麥芽黃酮和Vc，用65%乙醇溶液定容至500 mL 容量瓶中，得 0.1 mg?mL-1的黃酮溶液和 Vc 溶液。分別吸取 0.1 mg?mL-1黃酮溶液和 Vc 溶液 10，9，8，7，6，5，4，3，2，1 mL 置10 個10 mL 容量瓶中，65%乙醇溶液定容混勻，即得待測樣品溶液與Vc溶液。

取DPPH·乙醇溶液5 mL，分別加入不同濃度的黃酮溶液和Vc 溶液5 mL，振蕩器混勻后，室溫，避光放置30 min，在510 nm處測定吸光度，計算清除率[15]。

清除率=[A0-(A1-A2)]/A0×100%

式中：

A0—DPPH·溶液5 mL+無水乙醇5 mL的吸光度

A1—DPPH·溶液5 mL+樣品溶液5 mL的吸光度

A2—樣品溶液5 mL+無水乙醇5 mL的吸光度

(公式中引入A2是為了消除樣品溶液本身顏色對實驗測定的干擾)。

2.6.2 清除超氧陰離子O2-能力測定

稱取3.0285 g Tris 用蒸餾水溶解，加入114.5 mL 0.1 mol?L-1鹽酸溶液與蒸餾水定容至500 mL得到pH=8.2 的 50 mmol/L Tris-HCl 緩沖液。稱取 0.88 g 鄰苯三酚，用 0.01 mol?L-1鹽酸溶液溶解定容至 500 mL 得到7 mmol?L-1鄰苯三酚鹽酸溶液。取0.5 mL 不同濃度黃酮樣品溶液，加入6 mL pH=8.2 的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液，37℃水浴10 min，加入37℃預(yù)熱過的7 mmol?L-1鄰苯三酚鹽酸溶液1 mL，混勻后反應(yīng)4 min，加入5 mL濃鹽酸終止反應(yīng)。在紫外分光光度計325 nm 處測其吸光度A1，以等體積Tris-HCl 緩沖液座位空白測其吸光度A0。

稱取0.05 g 黃酮用65%乙醇溶液定容至500 mL容量瓶中，得 0.1 mg?mL-1的黃酮溶液。取 5 mg?mL-1黃酮溶液3，4，5，6，7 mL 至10 mL 容量瓶中，65% 乙醇定容即樣品溶液。量取2.1 mL 濃鹽酸加蒸餾水稀釋至250 mL 得到0.1 mol?L-1鹽酸溶液，同法配制相同濃度的Vc 溶液作為對比組，測定吸光度，按下列公式計算清除率[16]。

清除率%＝1-A1/A0×100%

2.6.3 羥自由基·OH清除能力測定

稱取13.609 g K2HPO4,加蒸餾水溶解定容至250 mL 為A 液；稱取65.644 g K2HPO4,加水溶解定容至500 mL 為 B 液，以 A∶B=19∶81 比例配置，得到 pH=7.4,0.2 mol?L-1磷酸緩沖液。稱取0.2478 g鄰菲羅啉,加蒸餾水溶解定容至250 mL為2.5 mmol?L-1鄰菲羅啉溶液。稱取1.0428 g 硫酸亞鐵，加水溶解定容至500 mL 為7.5 mmol?L-1硫酸亞鐵溶液。

稱取0.05 g 黃酮與Vc，用65%乙醇溶液定容至500 mL容量瓶中，得0.1 mg·mL-1的黃酮溶液。

取0.1 mg·mL-1黃酮溶液與 Vc 溶液10，9，8，7，6，5，4，3，2，1 mL至10個10 mL容量瓶中，用65%乙醇溶液定容至10 mL即待測樣品溶液與Vc溶液。

取10個相同比色管分別加入2 mL pH=7.4,0.2 mol?L-1磷酸緩沖液，0.3 mL 2.5 mmol?L-1鄰菲羅啉溶液，充分混勻后，加入 7.5 mmol?L-1硫酸亞鐵溶液 0.2 mL，每加一管立即混勻，然后向其中加入1.5 mL樣品溶液或Vc溶液，混勻，加入1%過氧化氫1 mL，再另做損傷管和未損傷管，其中損傷管中加入1%過氧化氫，未損傷管中不加1%過氧化氫，最后補充體積至8 mL，置37℃水浴恒溫1 h，在紫外分光光度計509 nm 處測其吸光度，按下列公式計算清除率[17]。

清除率%＝[(A2-A1)/(A0-A1)]×100%(式中：A2為樣品管，A0為未損傷管，A1為損傷管)

3 結(jié)果與討論

3.1 提取單因素實驗考察結(jié)果

3.1.1 浸泡時間

由圖1 所示，浸泡時間對總黃酮的提取率有一定的影響,隨著浸泡時間的增加,總黃酮的提取率逐漸增大；浸泡時間達(dá)到30 min 時, 總黃酮的浸提量達(dá)到最大值；隨著浸泡時間繼續(xù)增加, 提取率反而下降。因此,浸泡的最佳時間應(yīng)為30 min。

3.1.2 固液比

由圖2所示，隨著固液比的增加，蕎麥芽中總黃酮的提取率逐漸增大,在一定范圍內(nèi)提取劑用量的增加有助于黃酮物質(zhì)的浸出；當(dāng)料液達(dá)到1∶40 時,蕎麥芽中總黃酮的的提取率達(dá)到最大值；隨著提取劑用量的繼續(xù)增加, 總黃酮的提取率逐漸減少。因此，最佳固液比應(yīng)為1∶40。

3.1.3 乙醇百分濃度

由圖3 所示，乙醇百分濃度對總黃酮的提取率影響較大,當(dāng)乙醇百分濃度在30%-40%之間時,隨著乙醇濃度的增大,總黃酮的提取率逐漸增大；當(dāng)乙醇百分濃度為40%時, 總黃酮的提取率達(dá)到最大值；隨著乙醇百分濃度繼續(xù)增大,提取率反而下降。因此，乙醇百分濃度的最優(yōu)值應(yīng)為40%。

圖1 浸泡時間考察結(jié)果

圖2 固液比考察結(jié)果

圖3 乙醇百分濃度考察結(jié)果

3.1.4 提取溫度

由圖4 所示，提取溫度在30-60℃范圍內(nèi)，總黃酮提取率逐步隨溫度的升高逐步增加,當(dāng)提取溫度超過60℃時,總黃酮提取率略有下降,因此,最佳提取溫度應(yīng)為60℃。

3.1.5 提取時間

由圖5所示，隨著提取時間的增加，總黃酮的提取率增大，當(dāng)提取時間為90 min 時, 蕎麥芽中總黃酮的提取率最高；而提取時間超過90 min 后, 總黃酮的提取率略有下降。因此，最佳提取時間應(yīng)為90 min。

3.1.6 提取次數(shù)

由圖6所示，隨提取次數(shù)的增加，黃酮提取率呈現(xiàn)增加的趨勢，提取次數(shù)為3次時，蕎麥芽總黃酮的提取率最高；繼續(xù)增加提取次數(shù)，則黃酮的提取率迅速下降。因此，最佳的提取次數(shù)應(yīng)為3次。

3.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果及方差分析

通過單因素考察實驗，對影響提取率的各因素的變化規(guī)律有了基本的結(jié)論。其中，浸泡時間、提取溫度、提取次數(shù)等因素的實驗結(jié)果所反映的因素與提取率變化趨勢之間的關(guān)系較為明確，因此分別確定其工藝參數(shù)為：浸泡時間為30 min；提取溫度為60℃；提取次數(shù)為3 次。同時，為更加精準(zhǔn)確定主要因素的最佳條件，優(yōu)化提取工藝。在單因素考察基礎(chǔ)上，對固液比、乙醇百分濃度、提取時間等因素，以響應(yīng)面法設(shè)計實驗，進(jìn)一步優(yōu)選各因素工藝參數(shù)。

3.2.1 響應(yīng)面實驗結(jié)果

根據(jù)響應(yīng)面實驗設(shè)計，蕎麥芽黃酮的吸光度見表3。

3.2.2 方差分析

以提取率為響應(yīng)值，用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得到二次多項回歸方程[18-20]，式中各項系數(shù)的絕對值的大小代表各因素對提取率的影響，系數(shù)的正負(fù)代表影響的方向，對其進(jìn)行方差分 析 ， Y=0.66+7.625×10-3×A-0.061×B+0.089×C+0.047×A×B-0.037×A×C+0.035×B×C-0.078×A2-0.054×B2-0.13×C2，該提取模型P＜ 0.01，模型可信度高；失擬項P>0.05，失擬項不顯著，說明實驗數(shù)據(jù)與模型擬合良好。根據(jù)上述回歸方程作出響應(yīng)面分析表4。

圖4 提取溫度考察結(jié)果

圖5 提取時間考察結(jié)果

圖6 提取次數(shù)考察結(jié)果

表3 響應(yīng)面分析實驗結(jié)果

3.2.3 響應(yīng)面實驗驗證

根據(jù)Box-Behnken 軟件分析實驗數(shù)據(jù)并獲得響應(yīng)模型，保持三個因素中的一個不改變，得到乙醇濃度、固液比、提取時間之間兩個因素之間的三維響應(yīng)面與等高線，圖8—10 是各試驗因子對響應(yīng)值所構(gòu)成的三維空間響應(yīng)面－等高線圖，采用Design Expert 8.0.6軟件繪制，每個曲面表示一個變量保持最佳水平時，另外2 個變量間的相互作用。AB 交互作用P 值為0.0487，表示影響極顯著，說明提取濃度與提取時間之間的交互作用對蕎麥芽黃酮提取率存在極大影響，AC、BC 的交互作用不顯著；A 對黃酮提取率的影響不顯著，B對黃酮提取率的影響極顯著（P＜0.01），C對黃酮提取率的影響極顯著（P＜0.01），二次方項A2、C2對黃酮提取率的影響顯著。由模型分析得出的最佳提取條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù) 65.4%，料液比 1∶20，提取時間54.4 min。根據(jù)表中F值大小可知，三個因素對黃酮的提取效果的影響順序為：乙醇濃度>固液比>提取時間。

為驗證響應(yīng)面最終結(jié)果，利用已優(yōu)選出的實驗條件進(jìn)行實驗，同時為了實際操作方便可行，選定乙醇百分濃度65%，料液比 1∶20，浸泡30 min，提取時間55 min，提取3 次作為最佳工藝條件進(jìn)行驗證實驗。三次驗證實驗結(jié)果分別為：5.37%、5.50%、5.42%，三次重復(fù)實驗平均值為5.43%，RSD=1.2%(P＜2%)，說明實測結(jié)果與理論值沒有顯著性差異。

3.3 蕎麥芽黃酮的穩(wěn)定性芽研究

3.3.1 pH值對黃酮穩(wěn)定性的影響

由表 4 所示，pH=12 時，黃酮溶液在 30 min 時出現(xiàn)沉淀；pH=14 時，黃酮溶液在20 min 時出現(xiàn)沉淀。由此可知黃酮溶液在酸性條件下更穩(wěn)定，而在堿性強的條件下易受到破壞。因此，蕎麥芽及其黃酮制品存放時應(yīng)注意避免堿性環(huán)境。

表4 回歸模型方差分析

圖8 時間與固液對吸光度的影響等高線及3D曲面圖

3.3.2 金屬離子對黃酮穩(wěn)定性的影響

由表 5 所示，加入一定量的 Na+、K+、Al3+、Cu2+、Cd2+后，黃酮提取液顏色無明顯變化，十分穩(wěn)定，而加入 Ca2+、Cr2+、Fe3+后，顏色明顯發(fā)生變化，較不穩(wěn)定；黃酮溶液中加入鉛離子后0.08 h 時開始出現(xiàn)沉淀，表明黃酮對Pb3+極為不穩(wěn)定。因此，在生產(chǎn)加工及儲藏過程中，應(yīng)該避免接觸或使用可能含Mg2+、Ca2+、Fe3+、Pb3+的器物及試劑。

3.3.3 光照對黃酮穩(wěn)定性的影響

由表6所示，初期日光照射下降速率比紫外光快，后期日光照射下的降解速率比紫外光慢，表明該黃酮溶液光照時間短時間對紫外燈較穩(wěn)定，長時間光照條件下黃酮對日光較穩(wěn)定。因此，為保證其穩(wěn)定性，在儲存時應(yīng)避免陽光直射。

3.3.4 溫度對黃酮穩(wěn)定性的影響

由表7所示，當(dāng)受熱溫度低于70℃時，黃酮溶液的吸光度值基本不變，當(dāng)溫度大于70℃時，吸光度值逐漸增大。因此，蕎麥黃酮應(yīng)在低于70℃的條件下加工或保存。

3.3.5 氧化劑和還原劑對黃酮穩(wěn)定性的影響

由表8、9 所示，黃酮溶液中氧化劑H2O2和還原劑NaHSO4加入量在0.4-1.2 mL 時較穩(wěn)定，但隨氧化劑H2O2和還原劑NaHSO3加入量的增加，黃酮溶液吸光度值均降低且降幅較大。表明氧化劑H2O2和還原劑NaHSO3均明顯影響黃酮的穩(wěn)定性。因此，在保存或食品加工過程中應(yīng)盡量避免蕎麥黃酮與氧化劑或還原劑接觸或使用具有較強氧化、還原性質(zhì)的輔料及添加劑。

圖9 時間與乙醇濃度對吸光度的影響等高線及3D曲面圖

3.4 蕎麥芽黃酮抗氧化性能

3.4.1 有機自由基DPPH·清除能力的測定

由表 10 與圖 10 所示，黃酮和 Vc 對 DPPH 的清除效果如圖10 所示。由圖10 可以看出, 隨著黃酮濃度的增加, 其清除DPPH 的能力逐步增強。黃酮的抗氧化活性與Vc 的抗氧化活性趨勢相同且抗氧化能力接近Vc 活性，表明蕎麥芽黃酮具有一定的抗氧化活性。

3.4.2 清除超氧陰離子O2-能力測定

由表11與圖11所示，黃酮與Vc 對超氧陰離子O2-的清除效果如圖11 所示。由圖11 可以看出, 隨著黃酮濃度的增加,其清除超氧陰離子自由基(O2-·)的能力逐步增強并逐漸趨于穩(wěn)定，黃酮清除超氧陰離子O2-能力和Vc 清除超氧陰離子O2-能力相近，說明蕎麥芽黃酮具有一定抗氧化活性。

3.4.3 羥自由基·OH清除能力測定

由表12 與圖12 所示，黃酮和Vc 對羥基自由基·OH 的清除效果如圖12 所示。由圖12 可以看出,隨著黃酮濃度的增加,其清除羥基自由基·OH的能力逐步增強并逐漸趨于穩(wěn)定，黃酮清除羥基自由基·OH 和Vc 清除羥基自由基·OH 能力相近，說明蕎麥芽黃酮具有一定抗氧化活性。

3.5 討論

3.5.1 提取工藝研究

圖10 固液比與乙醇濃度對吸光度的影響等高線及3D曲面圖

單因素考察實驗結(jié)果中，提取率隨固液比增加，呈先增長后降低趨勢，可能是由于蕎麥芽中除黃酮之外，存在多糖、蛋白等，隨著提取液用量增大，溶解出更多的非黃酮類物質(zhì),影響黃酮類物質(zhì)的溶出或溶出的黃酮部分與溶液中的雜質(zhì)結(jié)合而在過濾等處理過程中損失，從而影響黃酮提取率；乙醇百分濃度增大導(dǎo)致提取率降低的原因可能是隨著乙醇百分濃度增高,溶劑極性降低，黃酮的溶解度下降，從而影響了黃酮在提取液中的溶出；溫度與提取率之間表現(xiàn)為隨著提取溫度升高，提取率由逐步增大到降低的曲線，分析其原因，可能是隨著提取溫度的升高,分子的運動速度加快, 細(xì)胞壁被破壞、溶劑分子滲透和溶質(zhì)擴散作用增強,黃酮的溶解度也相應(yīng)增大，使得黃酮自蕎麥芽細(xì)胞中迅速擴散出來,但當(dāng)提取溫度過高，黃酮熱不穩(wěn)定而造成部分被破壞，從而影響了提取率。浸泡時間與提取時間的實驗結(jié)果反映出如果時間過短,原料受溶劑的溶脹破壞不足，黃酮類物質(zhì)溶解不夠充分，隨著浸泡或提取時間的延長，溶劑的滲透與溶脹作用有助于黃酮自蕎麥芽向溶劑的擴散，但隨著時間的過度延長，非黃酮類物質(zhì)的擴散與溶出液大大增加，因而干擾了黃酮的提取；提取次數(shù)對于黃酮提取率具有一定的影響，提取次數(shù)過少，提取不完全，提取次數(shù)過多，可能在后幾次的提取中提出的雜質(zhì)較多，合并處理提取液的過程中，可能由于其他組分的吸附等造成黃酮含量的降低。

從響應(yīng)面的實驗結(jié)果，一方面可以看出固液比、乙醇百分濃度及提取時間的最佳參數(shù)與單因素考察結(jié)果存在一定差異，這是由于單因素考察是在固定其他條件的前提下，對某一單一因素進(jìn)行實驗研究，沒有考慮因素間的相互作用對實驗結(jié)果的影響，而實際上提取效果是各因素綜合作用的體現(xiàn)。如適宜的溶劑對目標(biāo)組分溶解較好，就會以較少量的溶劑溶出較多的目標(biāo)組分，同時也會以較快的速度達(dá)到溶出平衡，從而減少了提取劑用量，也縮短了提取時間；另一方面，響應(yīng)面結(jié)果表明提取時間對黃酮的提取率影響不顯著，提取時間與提取濃度的交互作用不顯著，固液比與提取濃度的交互作用不顯著，為工廠化生產(chǎn)蕎麥芽黃酮的適用性提供了依據(jù)。

表4 pH值對蕎麥芽黃酮穩(wěn)定性的影響

表5 金屬離子對蕎麥芽黃酮穩(wěn)定性的影響

表6 光照對蕎麥芽黃酮穩(wěn)定性的影響

表7 溫度對蕎麥芽黃酮穩(wěn)定性的影響

表8 H2O2處理對蕎麥芽黃酮穩(wěn)定性的影響

表9 NaHSO3處理對蕎麥芽黃酮穩(wěn)定性的影響

表10 不同濃度蕎麥芽黃酮對DPPH自由基的清除率

表11 不同濃度蕎麥芽黃酮超氧陰離子O2-的清除率

表12 不同濃度的蕎麥芽黃酮羥自由基·OH的清除率

圖10 蕎麥芽黃酮與Vc的DPPH清除率

圖11 蕎麥芽黃酮與Vc超氧陰離子清除率

總之，各提取因素最佳參數(shù)的篩選與確定應(yīng)依據(jù)系統(tǒng)的實驗研究并結(jié)合原料中所含物質(zhì)種類及其性質(zhì)綜合考慮，合理確定。

3.5.2 穩(wěn)定性實驗

圖12 蕎麥芽黃酮與Vc羥自由基·OH的清除率

金屬離子對蕎麥芽黃酮穩(wěn)定性影響實驗中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加入 Ca2+、Cr2+、Fe3+后，溶液顏色明顯發(fā)生變化，反映出黃酮在這幾種金屬離子存在的環(huán)境較不穩(wěn)定?？赡苁怯捎诖巳N離子與黃酮中的鄰二羥基發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)顯色，形成了有色配位物。

溫度實驗中發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度超過70℃后黃酮的穩(wěn)定性變差，其原因可能是高溫度破壞了黃酮結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生更多的酚羥基。

分別測定pH、金屬離子、光照、溫度、氧化劑和還原劑對于蕎麥黃酮提取液穩(wěn)定性的影響，測定結(jié)果表明：蕎麥黃酮溶液在酸性條件下更穩(wěn)定，在堿性強的條件下易受到破壞；蕎麥黃酮溶液對含Mg2+、Ca2+、Fe3+、Pb3+不穩(wěn)定，應(yīng)避免接觸含有 Mg2+、Ca2+、Fe3+、Pb3+的器物及試劑；蕎麥黃酮溶液光照時間短時間對紫外燈較穩(wěn)定，長時間光照條件下黃酮對日光較穩(wěn)定；蕎麥黃酮溶液在溫度低于70℃時穩(wěn)定；氧化劑 H2O2和還原劑 NaHSO3均明顯影響黃酮的穩(wěn)定性。

3.5.3 抗氧化性實驗

通過測定蕎麥黃酮提取液對DPPH 自由基、超氧陰離子O2-、羥自由基·OH 的清除能力，測定蕎麥黃酮的抗氧化性，結(jié)果顯示蕎麥黃酮抗氧化能力趨勢與Vc抗氧化能力趨勢相近，表明蕎麥黃酮具有一定的抗氧化能力。

4 結(jié)論

響應(yīng)面試驗設(shè)計優(yōu)選工藝具有簡便、易操作、穩(wěn)定、準(zhǔn)確可靠等特點，適用于各因素關(guān)系復(fù)雜的工藝研究，可用于優(yōu)化蕎麥芽黃酮提取工藝。采用Design-Expert 8.0.6 軟件 Box-Benhnken 設(shè)計，分別考察提取時間、固液比、乙醇濃度。優(yōu)化得到了提取效率較好的最佳組合:乙醇濃度65.4%、固液比1：20、提取時間55 min，吸光度為0.684。同時采用測定pH、金屬離子、光照、溫度、氧化劑和還原劑對于黃酮提取液穩(wěn)定性的影響，結(jié)果表明對黃酮穩(wěn)定性均有影響；測定黃酮提取液對DPPH、超氧陰離子O2-、羥自由基·OH的清除能力，以此考察蕎麥黃酮的抗氧化性，結(jié)果表明蕎麥黃酮抗氧化性良好，是一類具有良好應(yīng)用前景的抗氧化劑，可應(yīng)用于食品加工及營養(yǎng)制劑領(lǐng)域和醫(yī)藥日化等非食品行業(yè)，蕎麥黃酮具有止咳，平喘，祛痰，消炎，抗菌及降血糖等作用，對人體有多種生理功能，對于肥胖癥、糖尿病和心血管病有一定的療效，蕎麥芽黃酮的開發(fā)與應(yīng)用具有廣闊前景。