藥用植物質量性狀的分子研究進展＊

詹海仙，杜晨暉，李 睿，尚彩玲，張 瑜，胡 楠，裴香萍

（山西中醫藥大學中藥與食品工程學院 晉中 030619）

藥用植物是指全部或部分植株可以直接入藥或作為藥物生產的植物。我國藥用植物資源豐富，其應用已有幾千年歷史。尤其是來源于特定產區的道地藥材，由于具有藥用成分含量高、臨床效果好的優點，屬于我國的一種特色的傳統藥物[1]。造成藥用植物道地性與非道地性差異的主要原因包括種質資源、生長環境及氣候條件三個因素[2]，其中優良的種質資源是道地藥材優良品質形成的內在因素，由于特定的基因調控植物次生代謝產物等有效成分的產生，因此，種質資源包含的特定基因是藥材道地性形成的關鍵。由于大多數藥用植物為蟲媒異花授粉植物，栽培過程中易混雜，容易導致品種退化，進而造成品質和產量下降。因而研究種質資源道地性形成的內在機制和導致道地性形成的特定基因，是提高藥材品質和選育優良品種的基礎。

隨著分子生物學技術的不斷發展，藥用植物道地性相關質量性狀研究、分子遺傳圖譜構建及重要性狀基因的定位、克隆和轉化方面取得了較大的進展，也為優良性狀的定向培育提供了有效的指導工具。本文綜述了目前藥用植物道地性研究現狀、標記開發、遺傳圖譜構建、相關性狀數量性狀位點（QTL）定位、轉錄組測序、基因工程等技術對藥用植物相關性狀基因的挖掘現狀，以期為提高藥用植物種質資源的道地性研究提供參考。

1 藥用植物道地性研究進展

藥材品質關系到臨床用藥的有效性，而道地藥材是藥材品質的關鍵所在。道地藥材在其道地產區往往種植面積大，栽培管理規范，藥用成分含量高，因此，可獲得較大的經濟效益。黃璐琦院士的道地藥材形成的模式假說認為種質資源、生長環境及氣候條件是造成道地藥材與非道地藥材品質差異的主要原因[3]。國內外涉及藥用植物道地性相關的質量性狀的研究技術主要集中在下面幾個方面，利用高效液相色譜（HPLC）對道地和非道地的唇形科植物丹參中3 種藥用成分的含量進行了比較分析，證實道地產區的丹參中藥用成分含量遠高于非道地產區[4]。通過對毛茛科植物白芍進行HPLC 分析，建立了白芍道地性化學特征指紋圖譜，該指紋圖譜可用于白芍道地性和藥材質量評價[5]。利用HPLC 比較了不同基源和產地的桔梗科植物黨參的特征圖譜，并建立了山西道地藥材潞黨參的HPLC 特征圖譜[6]。HPLC 還建立了三白草科植物魚腥草、毛茛科植物附子和白芍以及五加科植物人參等藥用植物的特征指紋圖譜，為研究上述植物的道地性提供了一系列參考數據。

采用近紅外光譜技術可以快速區分道地產區與非道地產區的廣陳皮和當歸[7]。利用電子鼻傳感器的響應值作為指標對菊科植物白術和白菊、木犀科植物茉莉、薔薇科植物金櫻子氣味指紋變化進行分析[8-9]。分子標記技術在道地性藥材鑒定和分析上發揮了較大的作用，采用隨機擴增多態DNA（RAPD）標記結合HPLC 技術研究了3 個不同產地的山西道地藥材連翹的道地性[10]。將RAPD 標記與SCAR 標記結合，對羅漢果性別進行早期鑒定[11]。DNA 條形碼技術是從基因水平區分道地中藥材，近年來在中藥真偽品鑒別上的應用很多，將DNA 條形碼與ISSR 分子標記相結合鑒別不同產區的唇形科植物廣藿香[12]。通過DNA 條形碼技術可以準確區分紫丹參、冬蟲夏草和雪膽及其偽品[13]。但是，由于道地性為微效多基因控制的數量性狀，與單基因控制的質量性狀相比，數量性狀遺傳基礎復雜，常規方法難以對道地性相關的基因數目、位置、效應及作用方式進行分析[3]。隨著現代分子生藥學和測序技術的發展，數量遺傳學的方法，尤其是以分子遺傳連鎖圖譜和標記開發為基礎的標記-QTL 連鎖分析的方法成為揭示藥用植物道地性分子機理的重要手段。

2 藥用植物標記開發及遺傳圖譜構建

高密度的遺傳圖譜及QTL 定位研究有助于挖掘控制復雜性狀的重要性狀基因，分析相關性狀的遺傳機制。多態性的分子標記是構建遺傳圖譜并進行相關性狀QTL 分析的基礎。這些標記的開發為了解藥用植物的遺傳多樣性、種間遺傳分化和栽培育種提供分子生物學依據。簡單重復序列（SSR）、簡單序列重復區間擴增多態性（ISSR）、隨機擴增多態性（RAPD）、相關序列擴增多態性（SRAP、）靶位區域擴增多態性（TRAP）和擴增片段長度多態性（AFLP）等標記曾經是構建藥用植物遺傳圖譜的主要方法，構建了茄科植物甘薯、蘭科植物石斛、唇形科植物丹參、杜仲科植物杜仲、龍膽科植物龍膽、旋花科植物甘薯、十字花科植物蘿卜和光茸菌科植物香菇等藥用植物的遺傳圖譜。但是，由于這些標記在基因組中的豐富性較差，可用的標記數量少，構建的遺傳圖譜密度和飽和度均不高。

近年來，隨著測序技術迅猛發展，構建遺傳圖譜的分子標記不斷豐富，尤其是單核苷酸多態性（SNP）標記的大量發掘利用，極大的提高了植物遺傳圖譜的密度和飽和度[14]。SNP 標記具有多態性好、密度高、數量豐富且覆蓋全基因組的優點。基于測序技術開發相關標記，同時針對特異位點設計多種標記，結合多種標記技術為構建植物高密度遺傳連鎖圖譜提供了技術保障，這些標記已用于藥用植物連鎖圖譜的構建。目前，基于高通量技術的基因芯片技術、重測序（BSA）技術、混池轉錄組測序（RNA-seq）技術和簡化基因組測序（SLAF-seq，GBS）技術在藥用植物遺傳圖譜構建和相關性狀基因定位方面展現了較大作用。基因芯片技術構建了薔薇科植物桃的遺傳圖譜，簡化基因組測序技術（RAD）開發出蓮科植物栽培荷花、薔薇科植物山楂和玫瑰的高密度遺傳圖譜[15]。測序基因分型（GBS）和競爭性等位基因特異性PCR（KASP）分型技術結合獲得薔薇科植物杏和芍藥科植物牡丹的連鎖圖譜[16]。SLAF-seq 技術是通過限制性內切酶消化基因組DNA，降低了基因組的復雜度，且不依賴參考基因組序列，具有快速、準確鑒別標記優點。利用SLAF-seq技術分別構建了唇形科植物丹參、木犀科植物銀杏和桂花、芍藥科植物牡丹、蘭科植物鐵皮石斛、楊柳科植物旱柳、薔薇科植物梅花和豆科植物小豆的高密度遺傳圖譜[17-21]。多數遺傳圖譜均為該植物的首張遺傳圖譜，其中，梅花的高密度遺傳圖譜，連鎖圖上包含8 007 對引物，為梅花數量性狀基因定位和分子育種提供參考[21]。山東農業大學構建的丹參高密度遺傳圖譜，包含有8 個連鎖群，覆蓋率高達99.83%，為丹參農藝性狀基因的研究提供了重要信息[22]。牡丹的高密度遺傳圖譜全長920.699 cM，5 個連鎖群上引物間的距離僅有0.774 cM[23]。

上述遺傳圖譜為藥用植物道地性相關性狀基因鑒定和分析提供了重要遺傳信息（部分藥物的遺傳圖譜統計見表1）。同時，發出的大量分子標記可為藥用植物道地性相關基因定位和克隆工作奠定了基礎。

表1 部分藥用植物的遺傳圖譜統計

3 藥用植物相關性狀QTL定位研究

高密度遺傳圖譜構建和分子標記開發有助于對植物相關數量性狀QTL 定位研究。隨著藥用植物連鎖圖譜的不斷構建，大量藥用植物物相關性狀QTL 定位分析也得到了發展。薔薇科植物梅花的垂枝等15個重要性狀QTL 分析及候選基因的挖掘，將垂枝性狀定位到第7 號染色體，挖掘出預測參與基因轉錄調控的基因[21]。菊科植物菊花耐澇性相關的37 個非條件QTL 和51個條件QTL 位點分析，對于指導菊花耐澇性品種的分子選育工作具有重要意義[29]。薔薇科植物杏的殼硬度相關基因也進行了QTL 定位分析。玫瑰的花色 QTL 位點被定位到第 1、2、6 和 7 號染色體[30]。通過QTL 分析識別出與山楂黃酮類化合物含量相關的21 個QTL 位點，解釋16.30%-59.00%的變異[25]。豆科植物小豆開花時間相關的主效QTLs 位點和2 個微效QTLs 位點被識別[27]。篩選出與大豆總異黃酮含量相關的15 個QTL 位點50%[31]。18 個影響杜仲科植物杜仲生長相關性狀的QTL 位點被識別，對表型變異的解釋率為12.4%-33.3%，該遺傳連鎖圖譜為杜仲基因組標記輔助選擇和基因組研究提供了工具[32]。1 個與十字花科植物蘿卜根部鎘累積有關的主效QTL qRCd9被定位到第9 號染色體上，LOD 值為23.6[33]。上述藥用植物以遺傳圖譜為基礎并進行了相關性狀QTL 定位，對于進一步解析這些性狀的遺傳機制奠定了基礎。

4 轉錄組測序技術對藥用植物相關性狀基因的挖掘現狀

轉錄組測序分析可以批量挖掘物種功能基因，比較基因在不同樣品中的表達差異，為藥用植物功能基因的挖掘和次生代謝成分的生物合成途徑探索提供了新方法。目前，千種植物轉錄組計劃已完成1 000余種植物的轉錄組數據測序、歸檔和分析研究工作[34]。藥用植物包括唇形科植物丹參、菊科植物青蒿和燈盞花、三白草科植物魚腥草、五加科植物三七和人參、百合科植物七葉一枝花、豆科植物甘草及沙冬青、天南星科植物魔芋、玄參科植物地黃、蘭科植物鐵皮石斛、芍藥科植物牡丹、紅豆杉科植物紅豆杉、麻黃科植物麻黃、粟科植物博落回、茄科植物枸杞、夾竹桃科植物長春花、葫蘆科植物羅漢果、龍膽科植物龍膽、多孔菌科植物靈芝、木犀科植物連翹和桔梗科植物黨參等[35-40]。

通過轉錄組數據開發出海量的分子標記，為藥用植物道地性分析、遺傳圖譜構建等研究提供了參考。大量的藥用植物分子標記被開發，包括五加科植物刺五加、桑科植物桑葚、茄科植物黑果枸杞、杜仲科植物杜仲、唇形科植物夏枯草、毛茛科植物黃連、爵床科植物穿心連、百合科植物川貝母、蘭科植物金釵石斛、胡頹子科植物沙棘、無患子科植物文冠果、傘形科植物川芎、木犀科植物連翹以及豆科植物苦參、膜莢黃芪、蒙古黃芪、槐葉決明和中間錦雞兒等。涉及利用轉錄組數據開發出厚樸的SSR 和EST-SSR 標記，為厚樸的資源保護等研究提供了大量數據[41]。以轉錄組數據為基礎，開發出紅花EST-SSR 標記經不同種質紅花驗證，獲得多態性擴增條的引物可達40%以上[42]。肖亮等[43]通過對葛根轉錄組測序數據分析，設計開發出28對多態性引物，這些引物可用于不同葛根資源的遺傳多樣性分析。從三七轉錄組測序數據中確定了2 772個SSR，這些標記的開發為三七的分子標記輔助育種提供了參考數據[44]。

通過轉錄組測序挖掘出一些藥用植物活性成分合成的功能基因及相關的代謝通路，丹參轉錄組分析主要涉及丹參酮合成基因，黨參主要涉及黨參多糖合成相關基因，人參涉及皂苷生物合成途徑的酶和糖基轉移酶的基因，銀杏涉及黃酮類生物合成的基因，三七涉及皂甙生物合成途徑中相關的候選基因，連翹轉錄組分析主要涉及金絲桃素生物合成的基因，燈盞花測序主要涉及燈盞乙素合成的候選基因，羅漢果轉錄組測序涉及甜甙生物合成的候選基因，甘草涉及甘草酸合成的關鍵酶基因[46-50]。西洋參涉及所有與人參皂苷合成相關的酶基因，西藏延齡草涉及甾體皂苷生物合成等代謝過程中的基因，蒙古黃芪涉及異丙氨酸和三萜皂苷生物合成相關的基因，丹參涉及丹參素生物合成早期的編碼酶基因[50-53]。

5 藥用植物基因工程研究現狀

藥用植物的道地性體現在其次生代謝產物的含量及產量上，而人工栽培藥用植物普遍存在有效成分含量減少和品種退化等問題。隨著1983 年世界首例轉基因植物培育成功，基因工程技術近年來在農作物領域取得較大進展并逐步推廣，已克隆了不同來源的抗病、抗蟲、抗逆和抗除草劑的基因并進行轉化應用，減少了農藥和除草劑的使用及殘留，提高了農作物抗病性、抗逆性及產量。將上述基因轉入藥用植物，通過基因工程手段提高其次生代謝產物含量和病蟲害抗病能力，從而進一步提升藥材產量和品質。目前主要通過農桿菌介導的方式將一些抗性和熒光蛋白等模式基因導入蒿、石刁柏、枸杞、地黃、甘草、黃芩等藥用植物，且已獲得轉基因植株[54-55]。除草劑抗性基因轉入顛茄中，提高了顛茄和四倍體菘藍對除草劑的抗性[56-57]。四倍體菘藍和枸杞中分別轉入來自蘇云金芽孢桿菌的殺蟲蛋白基因、豇豆胰蛋白酶抑制劑基因和雪花蓮凝集素酶基因，轉基因植株分別具有對小菜蛾和蚜蟲抗蟲能力[58]。將抗微生物活性的抗菌肽分別導入陽春砂和魚腥草受體植株，獲得了抗菌活性強的轉基因植株[59-60]。將水稻的幾丁質酶基因和苜蓿的相關基因轉入白術植株，獲得了抗白術立枯病的陽性轉化植株[61]。在已知合成代謝途徑的情況下，還可通過基因工程的手段直接提高藥用植物次生代謝產物的含量。尤其是對于藥用成分含量比較低，常規育種已無法滿足生產需要的藥用植物，將反義鯊烯合酶基因轉入青蒿植株中，獲得的陽性轉化植株中青蒿素的含量得到較大的提高[62]。

轉基因植物需要進行安全評價和環境安全性評價，食用安全性評價包括毒理學評價和致敏性評價兩部分，與農作物長期食用不同，中藥僅在治療階段才需要食用，且中藥在食用前已經過炮制、煎煮等工藝處理，食用安全性方面相對比較可靠。環境安全性評價包括生存競爭能力評價、基因漂移環境影響評價、生物多樣性影響評價、靶標害蟲抗性風險評價。藥用植物種植面積較小，環境安全性方面更容易控制[55]。總之，不論農作物還是藥用植物，均需經過嚴格的食用性評價、環境安全性評價以及一系列安全評價審批程序才可獲得應用安全證書。

6 展望

藥用植物道地性提高的關鍵是適宜的生長環境、氣候條件及藥用成分含量高的種質資源，其遺傳機制屬于多基因作用下的數量性狀，是典型的連續性變異，主要表現在植物形態、生理機能和次生代謝產物上的特化。當前，對道地性形成的遺傳機制了解不足，成為制約藥用品質提高和品種選育的瓶頸之一。隨著現代分子生藥學和分子育種的快速發展及應用，挖掘與道地性直接相關的基因是道地性藥材基因工程研究和品種選育基礎。因此，在道地產區不變的基礎上，可利用現代分子生物學技術，尤其是高通量測序解析道地性形成的內在遺傳機制，明確道地性形成的數量性狀位點，定位、克隆相關基因并導入受體植株中。同時，除明確藥用植物本身的基因數量、位置、結構及其功能外，還應關注生長環境和氣候條件等外在因素變化對道地性的影響，了解環境因子與基因之間的互作關系，從而利用分子生物學手段可顯著提高道地藥材的藥用品質。