柔肝化纖顆粒促進BMSC向肝臟歸巢及其機制研究＊

吳姍姍，黎 妍，王振常，呂艷杭

（1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院 南寧 530222；2. 廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院脾胃肝病科 南寧 530201）

肝纖維化（Hepatic fibrosis，HF）是由各種損肝因素所致的肝臟內(nèi)結(jié)締組織異常增生的病理過程，細胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）彌漫性沉積過多而降解減少及肝竇毛細血管化是其主要的病理特征，是各種慢性肝病向肝硬化甚至肝癌轉(zhuǎn)化的必經(jīng)途徑[1]。在我國，乙型肝炎病毒（HBV）的持續(xù)感染是造成肝纖維化以及終末肝硬化的主要原因[2]。我國八桂大地屬乙型肝炎高流行區(qū)：乙肝感染陽性率高達10%，近16年來流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)乙肝的發(fā)病率呈明顯的逐年增高趨勢[3]。

目前，治療肝纖維化的藥物十分匱乏，針對肝纖維化的治療缺乏特異性靶向藥物。現(xiàn)有如皮質(zhì)類固醇激素、秋水仙堿、水飛薊素、干擾素等藥物效果單一，且療效與預(yù)后均不理想。近年來，間充質(zhì)干細胞（Marrow stem cells，MSCs）移植無疑是肝硬化患者的希冀。MSCs 屬于基質(zhì)干細胞異質(zhì)亞群，可從骨髓、脂肪組織、胎盤、臍帶血等不同組織中獲取，來源充沛。間充質(zhì)干細胞在骨髓中含量最為豐富，同時也最容易獲得，而臨床上，骨髓穿刺是一種簡單、常規(guī)、安全的技術(shù)。國內(nèi)外眾多研究表明，即使經(jīng)過經(jīng)多次傳代，間充質(zhì)干細胞仍具有穩(wěn)定的生物學(xué)特性，并且具有低免疫原性，如來源于患者自身，免疫相容，無排異反應(yīng)[4]。所以BMSCs 是干細胞移植治療的理想的候選細胞，更是組織工程技術(shù)中自體組織細胞的首選。然而，BMSCs 作為種子細胞發(fā)揮其強大的修復(fù)功能的關(guān)鍵是歸巢到組織的損傷部分[5]。

國際上對干細胞的研究多著眼于移植和克隆，而通過藥物激活內(nèi)源性的干細胞從而改善再生反應(yīng)與從外部植入干細胞是全然不同的新思路，在移植干細胞數(shù)量不夠替代肝功能且內(nèi)源性干細胞自身遭到破壞、修復(fù)能力有限的情況下，采用內(nèi)源性干細胞動員方案可以促進MSCs 等體內(nèi)干細胞歸巢肝臟分化為肝細胞及殘留肝細胞群擴展至足夠的數(shù)量和質(zhì)量，充分發(fā)揮中醫(yī)藥在維持或促進機體的正常再生修復(fù)的作用，且更關(guān)注如何利用中醫(yī)藥調(diào)控再生修復(fù)機制，減少對細胞數(shù)量的需求及無需培養(yǎng)擴增的繁瑣操作，為干細胞動員提供新的思路。

肝干細胞在不同狀態(tài)下分化能力的良莠不齊使研究者面臨另一個重要的問題，未來的研究需要證實干細胞衍生的人肝細胞樣細胞（HLCs）在患者體內(nèi)是否與內(nèi)源性肝細胞具有同等功能。目前，中藥成分誘導(dǎo)干細胞分化為肝細胞的報道很少，特別是對于細胞再生過程中干細胞的時空分布、分化過程及分化結(jié)果的影響尚未見報道。本研究采用先進的實驗研究技術(shù)系統(tǒng)從促BMSCs 富集、歸巢、分化、功能表達等方面調(diào)控肝臟再生，深入探討中藥聯(lián)合BMSCs 移植治療肝纖維化/肝硬化的協(xié)同增效的作用，用現(xiàn)代語言客觀闡述名老中醫(yī)學(xué)術(shù)理論，是本課題研究的必要性、目的、意義以及創(chuàng)新性。

中藥可以通過提高移植干細胞的存活和增殖能力、誘導(dǎo)其向肝細胞定向分化、改善移植后的病理環(huán)境等參與干細胞移植治療肝硬化，展現(xiàn)了其獨特的價值，且與其他誘導(dǎo)方法相比，具有安全、易于在臨床推廣使用等特點。柔肝化纖顆粒是廣西名中醫(yī)王振常結(jié)合自身26 年肝病臨床經(jīng)驗與全國名老中醫(yī)林沛湘的“壯肝逐瘀煎”內(nèi)涵及關(guān)幼波教授治療肝炎肝硬化有效驗方基礎(chǔ)上組方而成的。本課題的前期研究顯示，柔肝化纖顆粒含藥血清條件培養(yǎng)液可誘導(dǎo)BMSCs 向肝樣分化，但其具體作用機制尚不明確[6]。本研究擬通過動物模型實驗及體外細胞培養(yǎng)實驗，研究柔肝化纖顆粒促進大鼠BMSC 歸巢的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞分離及培養(yǎng)

取5周齡雄性SD 大鼠，頸椎脫臼處死。取股骨脛骨，保留骨骺，無菌處理后轉(zhuǎn)移至超凈工作臺內(nèi)，無菌血管鉗夾碎兩端骨骺，用吸滿PBS 的注射器把骨髓腔內(nèi)的骨髓沖洗出來，收集到離心管內(nèi)。將采集到的骨髓用密度為1.073 g·mL-1的Percoll分離液按照3∶2的比例緩慢滴加進行分離，依照3000 r·min-1，離心30 min，棄上清，用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基重懸，接種于細胞培養(yǎng)器皿中，在條件為37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h 后更換培養(yǎng)液，此后每3 天換液一次，待細胞匯合度至70%時傳代。使用Lipofectamine?2000 Transfection Reagent（Invitrogen，11668019），轉(zhuǎn)染p-EGFP-N1 質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后48 h 開始進行藥物篩選，篩選兩周后獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株，常規(guī)培養(yǎng)。

含藥血清制備：選取40只SD 大鼠，使用中藥柔肝化纖顆粒（組方：生黃芪45 g，生牡蠣30 g，黃精20 g 枸杞20 g，薏苡仁45 g，橘紅10 g，澤蘭30 g，雞內(nèi)金15 g，鱉甲30 g，虎杖20 g，丹皮12 g，大棗15 g）藥物配成中藥免煎顆粒，由廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院藥房配制（浙江江陰天藥業(yè)有限公司，規(guī)格：每1 g 配方顆粒相當(dāng)于飲片6 g），按1.1 g/kg的量灌胃，1次/d，干預(yù)15天后，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，常規(guī)消毒后暴露頸部動脈，頸動脈插管取血，分管盛裝，分組放置。血清過濾除菌后在4℃環(huán)境下保存?zhèn)溆谩＜毎麑嶒灧譃椋簩φ战M，柔肝化纖含藥血清（低、中、高濃度）組，經(jīng)含藥血清干預(yù)48 h后，收集用于后續(xù)實驗。

1.2 纖維化模型構(gòu)建及干預(yù)

取健康SPF 級雄性Wistar 大鼠24 只，體質(zhì)量100-120 g，采用CCL4復(fù)合因素肝硬化造模方法進行造模，大鼠隨機分為纖維化模型+干細胞注射組和纖維化模型+干細胞注射+柔肝化纖灌胃組，每組12只。由于肝臟具有強大的自然修復(fù)能力，為避免肝臟自然修復(fù)對實驗結(jié)果產(chǎn)生的誤差，于用藥開始后仍每周注射40%CCL4 油劑3 ml·kg-（1體質(zhì)量）一次。造模8 周后各組分別予以干細胞尾靜脈注射或干細胞尾靜脈注射+柔肝化纖顆粒灌胃，

1.3 qPCR檢測

RNA 提取及逆轉(zhuǎn)錄PCR：將30 mg 肝臟組織置于1000 μL Trizol 裂解液（Solarbio，R1100）中，充分裂解混勻后，加入500 μL 的氯仿，4℃，12000 g 離心15 min后取 400 μL 上層水相，加入 400 μL 異丙醇后，4℃，12 000 g 離心10 min 獲得RNA 沉淀，經(jīng)70%酒精洗滌后，晾干，使用無RNA酶水進行溶解，使用超微量核酸檢測儀（Suizhen，F(xiàn)C-1100）進行 RNA 濃度及純度檢測，后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Monad，RN05004M）說明書進行逆轉(zhuǎn)錄操作，所得cDNA 置于-20℃保存待用。（見表1）

qPCR 反應(yīng)體系為：SYBR Green Premix Taq（Monad，RN04006M）:5 μL，cDNA：1 μL，Primer Forward（10 μM）：0.3 μL，Primer Reverse（10 μM）：0.3 μL，H2O：3.4 μL，反應(yīng)程序：預(yù)處理 95℃：30 s；PCR 循環(huán)（40 循環(huán)）：95℃：5 s，60℃：30 s，72℃：15 s；溶解曲線：標準溶解曲線程序。實驗儀器為ABI 7500 定量PCR儀（ABI 7500）。經(jīng)實驗獲得的數(shù)據(jù)使用SPSS 軟件進行整理及分析，采用2-ΔΔCT 法進行分析，公式為：ΔCt= (Ct gene－Ct ACTB)，ΔΔCt= (ΔCt treat－ ΔCt control)。所得數(shù)據(jù)使用GraphPad（GraphPad Software 5.0）進行整理制圖。

1.4 WesternBlot檢測

組織蛋白提取：取30 mg組織塊置于離心管中，加入400 μL RIPA-PMSF 裂解液（Solarbio，R0010），組織勻漿機勻漿后于4℃，12 000 r·min-1離心5 min，取上清采用BCA 法測定蛋白含量。細胞蛋白提取：向細胞培養(yǎng)板中加入加入150-200 μL RIPA-PMSF 裂解液（Solarbio，R0010），于冰上充分吹打裂解后，于 4℃，12000 rpm 離心5 min，取上清采用BCA 法測定蛋白含量。4 × 蛋白上樣buffer（Solarbio，P1016）100℃變性5-10 min。蛋白電泳：80 V 恒壓電泳約20 min，待樣品進入分離膠層后，換用100 V 恒壓電泳1-1.5 h；轉(zhuǎn)膜：200 mA 恒流轉(zhuǎn)膜60-90 min。抗體孵育：用TBST（Solarbio，T1081）配制體積分數(shù)為8%的脫脂奶粉（Solarbio，D8340）作為封閉液，將膜放入封閉液中封閉3 h。按抗體說明書上的推薦比例使用封閉液將一抗（Anti-SDF1 抗體（Abcam，ab9797），Anti-CD62P 抗體（Abcam，ab59738），Anti-CD62E抗體（Abcam，ab18981），Anti-CD44抗體（Abcam，ab157107），重組Anti-CXCR4抗體[UMB2]（Abcam，ab124824），重組Anti-VCAM1 抗體[EPR5047]（Abcam，ab134047），Anti-Integrin alpha 4/CD49D 抗體（Abcam，ab202969）進行稀釋，將膜放入稀釋后的一抗中4℃孵育12 h。一抗孵育完成后，使用 TBST 洗膜 3 次，每次15 min。將膜放入按1∶3 000比例稀釋的二抗（goat anti-rabbit:Abcam，ab6721）中37℃孵育 1 h，使用 TBST（Solarbio，T1081）洗膜 3 次，每次 15 min 使用 ECL 顯色劑（Solarbio，PE0010）對膜進行顯色，于凝膠成像儀（Tanon，5200）中進行曝光成像。

1.5 肝臟組織冰凍切片及熒光拍照

新鮮肝臟組織固定液固定30 h，用手術(shù)刀把從固定液中取出的組織的目標部位修平整。將修切好的組織先經(jīng)15%的蔗糖溶液內(nèi)4℃冰箱脫水沉底后再轉(zhuǎn)入30%的蔗糖溶液內(nèi)4℃冰箱脫水沉底。將脫水后的組織取出放于包埋臺上，使用OCT 包埋劑進行包埋，冰凍切片機切片，厚度8-10 μm，將組織貼于載玻片上，-20℃保存?zhèn)溆谩１鶅銮衅瑥谋淠贸鰜韽?fù)溫，晾干水分，冷丙酮固定10 min，待丙酮完全干后于PBS（pH 7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3 次，每次5 min。滴加DAPI，避光室溫孵育10 min。充分洗脫DAPI后，使用抗淬滅封片劑封片，于尼康倒置熒光顯微鏡下拍照。

表1 引物設(shè)計

1.6 組織學(xué)檢測

取肝臟組織使用4%多聚甲醛固定，梯度經(jīng)久脫水，石蠟包埋，經(jīng)組織切片后進行H&E 染色及Masson染色，封片后使用顯微鏡拍照，分析肝臟病理及纖維化情況。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

本研究使用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 22.0 對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以均值±標準差（）表示，使用單因素方差分析（One-way ANOVA）對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理；P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 柔肝化纖顆粒可明顯改善肝纖維化情況

經(jīng)H&E 染色及Masson 染色，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，BMSC移植組及柔肝化纖顆粒聯(lián)合BMSC移植后，大鼠肝纖維化程度顯著降低（見圖1）。

2.2 柔肝化纖顆粒可促進BMSC向肝臟富集

組織冰凍切片熒光拍照結(jié)果顯示，使用柔肝化纖顆粒聯(lián)合BMSC 移植后，大鼠肝臟內(nèi)攜帶綠色熒光蛋白細胞數(shù)量明顯高于BMSC單獨移植組（見圖2）。

2.3 柔肝化纖顆粒可通過上調(diào)SDF-1/CXCR4 促進肝臟吸引BMSC

經(jīng)qPCR及WesternBlot檢測（見圖3），發(fā)現(xiàn)與單純干細胞干預(yù)組相比，柔肝化纖顆粒聯(lián)合干細胞干預(yù)組大鼠肝臟干細胞粘附相關(guān)基因（SDF-1、CD62P 和CD62E）mRNA 和蛋白表達量顯著上調(diào)（P<0.05），干細胞歸巢相關(guān)基因（CD44、CXCR4、VCAM-1 和CD49D）mRNA和蛋白表達量顯著上調(diào)（P<0.05）。

圖1 肝組織石蠟切片H&E染色及Masson染色觀察肝纖維程度

圖2 肝組織冰凍切片觀察外源注射熒光標記BMSC在肝臟內(nèi)分布情況

圖3 qPCR及WesternBlot檢測干細胞粘附相關(guān)基因（SDF-1、CD62P和CD62E）及干細胞歸巢相關(guān)基因（CD44、CXCR4、VCAM-1和CD49D）mRNA及蛋白表達水平

2.4 柔肝化纖顆粒在體外可增加BMSC的遷移能力

經(jīng)qPCR 及 WesternBlot 檢測（圖 4），與對照組相比，添加低濃度柔肝化纖含藥血清對干細胞歸巢相關(guān)基因（CD44、CXCR4、VCAM-1 和 CD49D）mRNA 和蛋白表達有上調(diào)作用，但差異不顯著（P>0.05），隨濃度升高，基因上調(diào)趨勢逐漸顯著（P<0.05）。

3 討論

肝硬化是各種慢性肝病的終末期表現(xiàn)，隨著生活水平的提高，酒桌餐飲文化的興起，人們的飲食結(jié)構(gòu)以高糖、高脂為主，由此產(chǎn)生的酒精性和（或）非酒精性脂肪肝日益增多，這些患者均有肝硬化的潛質(zhì)或已經(jīng)發(fā)展為肝硬化，因此肝硬化群體是十分巨大的。有研究表明，間充質(zhì)干細胞對肝纖維化或肝硬化等有潛在的治療作用，能夠定植于損傷部位，通過下調(diào)IL-17來改善肝臟炎癥[7]或抑制肝星狀細胞的增殖或誘導(dǎo)其凋亡，阻斷肝纖維化進程[8-9]。我國部分學(xué)者及本課題的小樣本臨床研究表明[6,10]，輸注BMSCs的耐受性和安全性良好并能使肝硬化患者獲益：改善肝功能、降低Child-Pugh 和 MELD 評 分 ，減 少 腹 水 及 死 亡 率[11]。BMSCs 需要歸巢到損傷部分才能發(fā)揮其修復(fù)作用，但BMSCs 在骨髓中含量極少（需要經(jīng)體外擴增才能滿足應(yīng)用要求，而體外培養(yǎng)、擴增條件的要求比較嚴格）及其向損傷部位歸巢的能力相對有限，影響了其臨床預(yù)期效果。

中醫(yī)學(xué)認為，腎藏精，主生殖、生長、發(fā)育，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)的干細胞具有的“自我更新”與“高度分化”特性不謀而和。兩者都在旨在揭示機體生長發(fā)育與生殖的基本生命規(guī)律。本研究的前期研究結(jié)果證實[6]柔肝化纖顆粒含藥血清條件培養(yǎng)液（以肝組織勻漿+10%胎牛血清為條件培養(yǎng)基）可誘導(dǎo)BMSCs 肝樣分化：可見細胞貼壁生長，透光度良好，21 天后細胞變大變圓，呈集落生長，表現(xiàn)為肝樣細胞形態(tài)，但其在體內(nèi)的具體作用途徑及干細胞歸巢機制尚不明確。

圖4 qPCR及WesternBlot檢測干細胞歸巢相關(guān)基因（CD44、CXCR4、VCAM-1和CD49D）mRNA及蛋白表達水平

BMSCs 的歸巢和植入的過程與白細胞遷移至炎癥部位再歸巢至淋巴結(jié)相似。此過程中，BMSCs 需跨越血管內(nèi)皮細胞與細胞外基質(zhì)進入骨髓龕位，與基質(zhì)細胞在黏附分子、SDF-1 及生長刺激因子作用下進行自我更新和增殖分化，從而實現(xiàn)了歸巢和植入[12]。黏附分子E-選擇素和P-選擇素介導(dǎo)干細胞在內(nèi)皮細胞層的滾動，隨后內(nèi)皮細胞分泌的SDF-1 激活CXCR4 陽性的干細胞并觸發(fā)了LFA-1/ICAM 和VLA-1/VCAM-1 之間相互作用而使干細胞黏附于內(nèi)皮細胞上[13]。而VLA-1 和VLA-5 與細胞外基質(zhì)纖維結(jié)合素的作用使干細胞穿過細胞外基質(zhì)并順著SDF-1 濃度梯度遷移至骨髓龕位[14]。可見，BMSCs的歸巢和植入過程中SDF-1/CXCR4 相互作用從始至終都發(fā)揮著決定性作用[15]。在動物實驗中，本研究發(fā)現(xiàn)與單純干細胞干預(yù)組相比，柔肝化纖顆粒聯(lián)合干細胞干預(yù)組大鼠肝臟干細胞粘附相關(guān)基（SDF-1，CD62P 和 CD62E）mRNA 和蛋白表達量顯著上調(diào)（P<0.05），說明經(jīng)柔肝化纖顆粒干預(yù)后，大鼠肝臟粘附分子表達量顯著上調(diào)，可募集更多的干細胞遷移至肝臟區(qū)域，從而進行后續(xù)的轉(zhuǎn)分化及修復(fù)。通過對BMSC 干預(yù)后大鼠肝臟中干細胞歸巢相關(guān)基因CD44、CXCR4、VCAM-1 和 CD49D 的 mRNA 和蛋白表達量進行檢測后，發(fā)現(xiàn)柔肝化纖顆粒干預(yù)下可顯著提高肝臟內(nèi)干細胞歸巢相關(guān)指標的上調(diào)（P<0.05），此發(fā)現(xiàn)證實經(jīng)柔肝化纖顆粒干預(yù)后，肝臟可有效募集BMSC 歸巢至受損肝臟區(qū)域。在體外BMSC 細胞實驗中，經(jīng)較高濃度柔肝化纖含藥血清干預(yù)后，本研究發(fā)現(xiàn)BMSC 干細胞歸巢相關(guān)基因的mRNA 和蛋白水平顯著上調(diào)（P<0.05），此結(jié)果與動物實驗結(jié)果相吻合，證明柔肝化纖顆粒是激活BMSC 活躍歸巢的關(guān)鍵因素。

BMSC 移植是公認的最具應(yīng)用前景的肝纖維化及肝硬化干細胞治療手段，隨著對BMSC 歸巢及肝臟募集作用機制的不斷深入研究，并對其后續(xù)定向分化為肝細胞的微環(huán)境作用進行深入探討，利用我國寶貴的中醫(yī)藥資源，促進BMSC 向干細胞歸巢并分化，修復(fù)受損肝臟組織，將為肝纖維化與肝硬化的治療帶來全新的變革。中藥柔肝化纖顆粒可通過SDF-1/CXCR4 軸促進BMSC 歸巢相關(guān)基因及蛋白表達，促進干細胞向肝纖維化肝組織歸巢，并提高受損肝臟募集干細胞的水平，修復(fù)受損肝臟。