知母抗老年癡呆有效部位篩選及作用機制研究＊

羅 潔，黃永亮，鄭 繪，魏京霞，涂 勤＊＊

（1. 成都市第六人民醫院藥劑科 成都 610051；2. 成都中醫藥大學附屬醫院藥學部 成都 610072）

老年癡呆即阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD），是一種與年齡相關的神經退行性疾病，在認知、學習記憶、執行功能等方面都存在著很大障礙[1]。目前，老年癡呆是影響全球的公共健康問題，嚴重影響患者生活質量，給患者、患者家庭和社會帶來巨大負擔。但至今沒有發現一種可以徹底根治AD 的藥物。目前用于治療AD 的藥物主要有膽堿酯酶抑制劑、抗氧化藥物、神經營養藥物及免疫治療藥物等[2]。研究表明AD 的發病機制復雜，臨床常用治療AD 的藥物均屬于單靶向藥物，只能改善或緩解患者的癥狀，并不能延緩或阻止疾病的進程，因此迫切需要開發既能改善又能緩解疾病進程的藥物。中藥因其化學成分復雜多樣，臨床治療作用是多靶點、多成分結合的效果，因此，人們把研究方向轉移到中藥上，包括當歸、人參、遠志、黃芪、文冠果、知母等[3-4]。

知母為百合科植物知母（Anemarrhenae asphodeloidesBge.）的干燥根莖，具有清熱瀉火、滋陰潤燥的功效，用于外感熱病，高熱煩渴，肺熱燥咳，骨蒸潮熱，內熱消渴，腸燥便秘[5]。知母的化學成分主要有甾體皂苷、雙苯吡酮類、黃酮類、木脂素類、多糖類、有機酸類及微量元素等，而皂苷類是其主要成分之一，約占知母根莖的6%[6]。有研究表明，知母乙醇提取物能預防和改善阿爾茨海默病模型小鼠的學習記憶減退[7]，知母皂苷 BⅡ(Timosaponin B-Ⅱ，TB-Ⅱ)對自然衰老大鼠具有改善學習記憶能力和保護海馬區神經元的作用[8]，菝葜皂苷元能顯著改善多種動物模型的學習記憶功能，是一種新型的能顯著改善學習記憶功能的藥物[9]。作者前期研究了知母的指紋圖譜和相關成分的含量測定，發現知母化學成分復雜多樣[10-11]，其臨床治療作用也應是多成分、多靶點的結合的效果，所以，本實驗從知母提取液的不同極性部位出發，尋找知母抗老年癡呆的有效部位。進一步研究知母乙醇提取物及其不同極性部位對東莨菪堿所致小鼠學習記憶能力獲得性障礙的改善作用，并結合自由基學說和膽堿能學說，探討知母抗老年癡呆的作用機制，初步確定了知母抗老年癡呆的有效部位。

1 材料

1.1 動物

健康雄性昆明種小鼠，體重18-22 g，由成都中醫藥大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK2010-0001。

1.2 藥材、藥品與試劑

知母（四川省新荷花中藥飲片有限公司）經成都中醫藥大學張廷模教授鑒定為正品；吡拉西坦片（東北制藥集團有限公司，批號180623）；氫溴酸東莨菪堿注射液（上海禾豐制藥有限公司，批號180403）。超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛(MDA)、乙酰膽堿酯酶（AchE）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；95%乙醇，石油醚，乙酸乙酯，正丁醇均為國產分析純試劑，乙腈（色譜純）；水（娃哈哈純凈水）。知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷Ⅰ、知母皂苷AⅡ均為實驗室自制（經核磁和質譜鑒定，采用峰面積歸一化法計算含量，純度≥98%）。

1.3 儀器

RE-52A 旋轉蒸發儀（上海亞榮生化器械廠）；Morris 水迷宮（北京碩林苑科技有限公司）；多功能酶標儀（Thermo Fisher）；BP210S 電子天平（德國Sartorius公司），AB135-S十萬分之一天平（METTLER TOLEDO儀器有限公司）；Agilent 1100 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；Alltech ELSD 2000ES 蒸發光散射檢測器（美國Alltech 公司）。

2 方法

2.1 藥物的制備

2.1.1 灌胃藥液的制備

知母飲片1 kg，用75%乙醇加熱回流提取3 次，濃縮至無醇味，取一部分作為總提取物灌胃，再分別萃取得到石油醚層、乙酸乙酯層、正丁醇層、水層浸膏[12]。各組分別加蒸餾水配制成1 g·mL-1（按生藥計算）供試液準備灌胃。

2.1.2 供試液的制備

取知母正丁醇層組份1.0 g，精密稱定，置于10 ml量瓶中，加乙腈溶解并定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 對照品溶液的制備

分別精密稱取4 種知母皂苷對照品適量，乙腈溶解，作為對照品儲備液。精密量取各儲備液適量，置于同一10 ml 量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2 分組、給藥與造模

將96 只小鼠隨機分為8 組：石油醚層組，乙酸乙酯層組，正丁醇層組，水層組，總提物組，吡拉西坦組（500 mg·kg-1），模型組，空白組。各組均按20 mL·kg-1灌胃給藥，空白組與模型組灌胃等量蒸餾水，其余各組灌胃相應的供試液，每天1 次，連續21 天。第16 天開始在完成上述給藥30 min 后，除空白組外各組小鼠腹腔注射氫溴酸東莨菪堿注射液（1 mg·kg-1）以制備學習記憶障礙模型，空白組小鼠注射等體積的0.9 %氯化鈉注射液。注射后30 min進行Morris水迷宮實驗。

2.3 Morris水迷宮實驗

Morris 水迷宮為一內壁被漆成黑色的圓形水池，直徑70 cm，高40 cm，水深20 cm，水溫（22±1）℃，池壁等分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ個象限。在第Ⅰ象限（目標象限）中放入一個直徑為7 cm 的黑色圓形平臺，平臺頂低于水面1 cm，水中加入墨汁，迷宮四周存在豐富的參照線索，以供動物定位平臺，實驗期間迷宮外的參照物保持不變[13]。實驗前5 天進行定位航行試驗，將小鼠面對池壁，分別從Ⅱ、Ⅲ象限的入水測試，每只小鼠每天連續訓練2 次，時限設置為每次120 s，平臺停留時間20 s，記錄各組小鼠的潛伏期（從入水到搜索到安全平臺的時間），未搜索到平臺的小鼠將其放置于平臺20 s，潛伏期記為120 s。實驗d 6 為空間探索試驗，撤去平臺，將小鼠從第Ⅰ象限的對側入水測試一次，持續60 s，記錄小鼠在原平臺象限游泳時間占總游泳時間的百分比和穿臺次數。

2.4 樣品處理及檢測

Morris 水迷宮試驗結束后，立即眼眶取血，冰上取腦并分離海馬和皮質，預冷生理鹽水沖洗表面血液，濾紙擦干。用玻璃勻漿器加預冷生理鹽水研磨制成10% 的組織勻漿，3 500 r·min-1低溫離心 10 min，取上清。血液經3 500 r·min-1離心，取血清[14]。按試劑盒操作說明分別對血清中的SOD，MDA；皮質和海馬中的AChE含量進行測定。

2.5 色譜條件

Thermo C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈-水（21：79V/V），流速為1.0 ml·min-1，進樣量為10 μL，ELSD檢測器漂移管溫度：95℃；氮氣流速：2.5 L·min-1。

2.6 統計學處理

3 結果

3.1 Morris水迷宮實驗行為學測試

3.1.1 定位航行實驗

在定位航行實驗過程中，隨著訓練時間的延長，各組小鼠的逃避潛伏期都有下降的趨勢，并且從第1天開始，與空白組比較，模型組小鼠的逃避潛伏期明顯延長，差異具有統計學意義（P<0.01），說明東莨菪堿致小鼠學習記憶障礙模型建立成功。與模型組比較，正丁醇組從實驗d 2 天開始逃避潛伏期顯著縮短，總提物組從實驗d 4 天開始逃避潛伏期顯著縮短，差異具有統計學意義（P<0.01，P<0.05），結果見表1。

3.1.2 空間探索實驗

在空間探索實驗中，與空白組比較，模型組小鼠在目標象限游泳時間占總時間的百分比顯著減少，穿越平臺的次數顯著減少，差異具有統計學意義，（P<0.01，P<0.05）。與模型組比較，正丁醇組在目標象限游泳時間占總時間的百分比和穿越平臺次數顯著增加，差異具有統計學意義（P<0.01，P<0.05），總提物組也能增加小鼠在目標象限的游泳時間百分比和穿越平臺的次數。結果見表2。

表1 各組小鼠在定位航行各時段的平均潛伏期（，n=12）

表1 各組小鼠在定位航行各時段的平均潛伏期（，n=12）

注：與空白組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較，※P<0.05，※※P<0.01。

d5 46.79±28.57△△42.85±22.58△25.60±19.21※※47.72±41.49△△31.67±24.46※38.84±36.10△56.2±28.22△△16.01±15.89※※組別石油醚組乙酸乙酯組正丁醇組水層組總提物組吡拉西坦組模型組空白組d1 104.91±37.65△△76.58±36.40△80.98±29.15△74.18±42.60 91.04±38.58△98.33±33.40△△86.80±40.50△△51.08±27.86※※d2 76.18±39.45△△42.74±30.96※※41.2±28.32※※45.79±26.93※※67.07±43.91△57.98±37.52※89.62±37.97△△34.37±27.13※※d3 49.86±34.32 38.11±25.16※37.09±20.07※※54.15±37.98△47.21±26.86 58.72±34.01△△70.62±42.42△△25.41±31.36※※d4 41.57±38.05 39.85±24.91 29.14±23.35※※58.71±38.00△35.94±22.73※59.59±45.10△64.14±41.35△△30.01±18.05※※

表2 各組小鼠的空間探索實驗結果（，n=12）

表2 各組小鼠的空間探索實驗結果（，n=12）

注：與空白組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較，※P<0.05，※※P<0.01。

穿越平臺次數1.69±1.80△2.46±1.30 3±2.26※2.23±1.51 2.76±2※2.46±1.61 1.46±1.62△3.07±1.50※組別石油醚組乙酸乙酯組正丁醇組水層組總提物組吡拉西坦組模型組空白組目標象限游泳時間占總時間的百分比/%18.89±9.70△△24.98±6.21△△※34.23±9.97※※24.11±9.01△△29.90±7.01※※31.42±13.10△△17.37±10.53△△35.43±7.02※※

3.2 對小鼠血清SOD活性、MDA含量的影響

檢測結果顯示（見表3），與空白組比較，模型組小鼠SOD 活性降低和MDA 含量升高，差異具有統計學意義（P<0.01）。與模型組比較，正丁醇組SOD 活性升高和MDA 含量下降，差異具有統計學意義（P<0.05，P<0.01），總提物組也有改善，但正丁醇組效果要優于總提物組。

3.3 對小鼠腦皮質和海馬區AChE活力的影響

檢測結果顯示（見表4），與空白組比較，模型組小鼠腦皮質和海馬區的AChE 活性顯著增加，差異具有統計學意義（P<0.01，P<0.01）。與模型組比較，正丁醇組小鼠腦皮質和海馬區的AChE 活性明顯降低，差異具有統計學意義（P<0.05，P<0.01）?？偺嵛锝M小鼠腦皮質和海馬區的AChE 活性也有所降低但效果不及正丁醇組。

表3 知母提取物對癡呆小鼠血清SOD、MDA的影響（，n=10）

表3 知母提取物對癡呆小鼠血清SOD、MDA的影響（，n=10）

注：與空白組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較，※P<0.05，※※P<0.01。

MDA(nmol/ml)4.682±0.985※※6.318±1.218※※△10.05±1.009△△3.318±0.985※※組別正丁醇組總提物組模型組空白組SOD(U/ml)312.222±65.81△※266.212±55.998△△232.721±51.177△△368.563±124.870 ※※

表4 知母提取物對癡呆小鼠皮質和海馬乙酰膽堿酯酶活力的影響（，n=10）

表4 知母提取物對癡呆小鼠皮質和海馬乙酰膽堿酯酶活力的影響（，n=10）

注：與空白組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較，※P<0.05，※※P<0.01。

海馬7.653±0.859※※8.687±1.364※※△△12.94±0.831△△5.007±1.02※※組別正丁醇組總提物組模型組空白組AChE 活性（U/mgprot）皮質3.793±0.621※4.675±1.424△△5.483±1.223△△2.620±0.324※※

3.4 正丁醇層的主要化合物

分別吸取混合對照品溶液和供試品溶液，按“2.5”項色譜條件，分別進樣，記錄色譜圖，結果表明，在上述色譜條件下，知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷Ⅰ、知母皂苷AⅡ，4 種成分分離良好，可見知母正丁醇層主要包含皂苷類成分，見圖1。

4 討論

東莨菪堿致癡呆模型小鼠是基于“膽堿能功能缺損”病因假說所建立起來的[15]。作為一種非選擇性M 受體阻斷劑，東莨菪堿可以拮抗乙酰膽堿與M受體的結合，阻斷大腦信息的傳遞，干擾短期記憶能力，從而導致小鼠學習記憶障礙[16]。東莨菪堿制備的癡呆模型被廣泛應用于初步篩選促智藥物和防治阿爾茨海默病的藥物，是一種常用、快速、簡單的藥物篩選模型。本實驗給予小鼠腹腔注射氫溴酸東莨菪堿注射液（1 mg·kg-1），可造成獲得性學習記憶障礙，與文獻報道一致[17]。

圖1 對照品混合溶液（A）和知母正丁醇層（B）的HPLC-ELSD色譜圖

Morris 水迷宮實驗是一種經典的，應用于多種AD動物模型認知功能檢測的有效實驗方法。實驗原理易懂，操作簡便，數據誤差較小，可提供較多的評價參數，比如逃避潛伏期，逃避潛伏路程，各象限停留時間等，更加全面系統地反映動物模型空間學習記憶能力。本實驗通過Morris 水迷宮測定小鼠的定位航行和空間探索能力，觀察小鼠的空間學習記憶的獲取能力和儲存能力。結合特定的迷宮系統及攝像系統和專用的統計軟件，使學習記憶實驗研究的觀測指標較多而全面，同時測定精度好，在此基礎上研究知母提取物對小鼠學習記憶行為的影響有一定的意義。

SOD 為自由基清除過程的重要酶，主要作用是參與催化產生超氧自由基，清除并阻斷自由基的產生。MDA 是氧自由基破壞細胞后的產物，它的存在可以使生物膜壞死，同時抑制SOD 的活性，造成自由基的大量產生。大量實驗證實，老年癡呆病人腦內氧化程度較高，氧自由基的存在可以引起腦細胞損傷，可能是引起AD 發病的原因之一。SOD 是一種金屬酶，它是體內非常重要的自由基清除劑。因此SOD 可以直接反應機體的抗氧化能力[18]。體內自由基與細胞膜不飽和脂肪酸發生過氧化反應，形成脂質過氧化物，MDA 是脂質過氧化物的最終產物，比較穩定，其含量高低可反應脂質過氧化水平，在一定水平上反應細胞損傷的程度[19]。因此檢測模型小鼠體內SOD、MDA 的含量對探討知母有效部位抗老年癡呆的作用機制具有重要意義。

在中樞神經系統中，腦皮質和海馬的結構和功能改變與衰老和記憶密切有關[20]。中樞膽堿能遞質在學習與記憶行為中有重要的調節作用，與AD 關系最密切的神經遞質是乙酰膽堿（Acetylcholine,ACh），AChE能水解ACh 生成膽堿和乙酸。人體缺少ACh 則會加速腦細胞的衰老，使記憶力顯著下降，甚至導致老年癡呆。AChE 是ACh 的特異膽堿酯酶，其活力變化可以間接反映ACh 的代謝狀況。所以檢測腦皮質和海馬區AChE活性具有重要意義。

本實驗對小鼠進行預防性給藥16天后，給予腹腔注射氫溴酸東莨菪堿進行造模，連續6 d，造成學習記憶功能受損。以上實驗結果表明知母正丁醇部位能夠明顯改善模型小鼠的學習記憶能力，并能提高血清中SOD 活性，降低MDA 含量，降低前額皮質和海馬區AChE 活性。以上實驗結果表明，知母正丁醇部位抗老年癡呆的作用可能與其抗氧化作用和抑制膽堿酯酶活性有關。

本實驗為進一步研究知母皂苷單體成分治療AD提供了依據。