單羧酸轉運蛋白4在胰腺癌中的表達及臨床預后價值

徐帥帥， 李 碩， 李 浩， 葉龍云， 劉 亮， 虞先濬， 徐華祥

復旦大學附屬腫瘤醫院胰腺外科，上海市胰腺腫瘤研究所，上海 200032

胰腺癌是惡性度極高的消化道腫瘤之一。根治性手術是胰腺癌患者獲得長期生存的唯一手段，但其術后5年生存率僅20%，其中術后高復發率是胰腺癌患者術后預后不良的主要因素[1-2]。因此，探尋新的指標監測胰腺癌術后復發狀態顯得尤為重要。單羧酸轉運體(monocarboxylate transporter，MCT)屬于溶質運載蛋白家族(solute carrier family，SLC)16A 亞家族的成員。MCTs主要通過調控糖酵解過程中產生的乳酸、丙酮酸、丁酸、脂肪酸等一元羧酸類物質在細胞膜上的跨膜轉運，實現提高腫瘤細胞的糖酵解能力和維持腫瘤周圍的酸性微環境的功能[3]。MCT4在胃癌、前列腺癌和宮頸癌中均有顯著表達，并參與了腫瘤惡性進展的過程[4]。本研究通過分析MCT4在胰腺癌組織中的表達分布與水平，以及其與臨床病理特征之間的關系，為胰腺癌術后復發高風險人群的篩選和術后治療策略的制定提供潛在方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性收集2010年2月至2014年6月在復旦大學附屬腫瘤醫院胰腺外科(上海市胰腺腫瘤研究所)接受根治性切除的441例胰腺癌患者的臨床資料，依據以下排除標準納入379例。(1)臨床病理資料和隨訪資料不全(n=9)；(2)術前接受抗腫瘤治療 (n=41)；(3)既往其他惡性腫瘤史 (n=12)。本研究所的數據庫登記了所有入組患者的臨床病理特征、治療方式及隨訪數據。本研究經由復旦大學附屬腫瘤醫院倫理委員會批準，所有患者簽署了知情同意書。

1.2 患者隨訪 依據本研究所胰腺癌術后隨訪的標準流程，每例患者在術后均接受常規隨訪至腫瘤復發或死亡[5]。患者術后至少每2個月來院例行體格檢查和實驗室檢查。如果懷疑存在腫瘤復發風險，就建議患者行影像學檢查(上腹部增強計算機輔助影像、上腹部增強磁共振、骨掃描和正電子計算輔助影像)。總體生存(overall survival，OS)時間定義為從患者手術日至術后死亡或最后1次隨訪之間的時間段；無復發生存(recurrence-free survival，RFS)時間定義為從患者手術日至術后復發或最后1次隨訪之間的時間段。本組胰腺癌患者術后的中位生存時間約為17個月，術后最后1次隨訪時間超過17個月。

1.3 免疫組化 在由甲醛固定和石蠟包埋的組織切片上，采用二甲苯逐級脫蠟和梯度乙醇逐級水化，運用檸檬酸進行抗原修復，并采用MCT4抗體(ab244385，1∶100稀釋，Abcam公司)孵育和生物素標記的二抗進行顯色。應用萊卡攝像機攝取免疫組化染色切片圖片，并用與此攝像機連接的萊卡DM IRE2顯微鏡(萊卡顯微圖片拍攝系統，英國)，將每個病例的免疫組化染色切片在200倍鏡下分別選取3個代表性區域 (主要由腫瘤實質細胞組成，避開壞死組織區域)，判斷組織染色情況。陽性判定標準：>10%的腫瘤細胞呈現胞質或質膜褐色染色。免疫組化染色結果由2名臨床醫師獨立綜合判斷；若判定結果存在分歧，由2名臨床醫師商定。

1.4 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件錄入數據并進行統計分析。數據經過正態性檢驗和方差齊性檢驗后，使用非配對t檢驗(雙側)和卡方檢驗驗證統計學差異。采用log-rank檢驗對比MCT4陽性表達與陰性表達組患者之間的生存差異。將Cox單因素分析中差異有統計學意義的指標納入多因素Cox回歸分析模型，分析OS和RFS時間的獨立預測因子。檢驗水準(α)為0.05。

2 結 果

2.1 379例胰腺癌臨床病理特征與預后情況 379例患者中，男性218例，年齡33～84歲(中位61歲)，222例腫瘤位于胰頭，腫瘤最大徑0.5～11.5 cm (中位4.0 cm)。176例腫瘤存在淋巴結轉移，141例腫瘤病理分級為低分化，72例腫瘤存在脈管侵犯，321例腫瘤存在神經侵犯，300例患者術前血清糖類抗原19-9(CA19-9)水平異常升高。截至最后1次隨訪，325例患者復發，其中294例死于腫瘤復發。中位OS和RFS時間分別為17.0個月和9.5個月；1年和3年OS率分別為61.4%和24.8%，1年和3年RFS率分別為37.1%和13.8%。

2.2 MCT4在胰腺癌組織中的表達及其與臨床病理特征的關系 MCT4主要在胰腺癌細胞的胞質和質膜上表達，在癌細胞周圍的間質細胞中也有散在表達，在正常胰腺組織中為陰性表達(圖1)。MCT4在208例患者的胰腺癌組織中呈現陽性染色。結果(表1)表明，MCT4陽性表達患者的腫瘤最大徑更大(P=0.004)、淋巴結轉移率更高(P=0.005)、TNM分期更高(P=0.011)。

圖1 MCT4在胰腺癌及正常胰腺組織中的表達

表1 胰腺癌組織中MCT4表達與臨床病理特征的關系 n(%)

2.3 生存時間的影響因素 單因素Cox回歸分析(表2，表3)表明，CA19-9水平升高、較大的腫瘤最大徑、淋巴結轉移、高TNM分期和MCT4陽性表達是胰腺癌患者OS和RFS的危險因子(P<0.05)。MCT4陽性患者的中位OS (12.4個月)和RFS(7.3個月)時間顯著短于MCT4陰性患者(21.3個月，P<0.001；11.4個月,P<0.001)。多因素Cox回歸分析(表2，表3)顯示，MCT4陽性表達是胰腺癌患者OS和RFS的獨立危險因子之一(P<0.001)。

表2 胰腺癌患者OS時間的影響因素分析

表3 胰腺癌患者RFS時間的影響因素分析

3 討 論

代謝重編程是腫瘤細胞的重要生物學特征之一。腫瘤細胞通過代謝重編程方式提高糖酵解代謝的能力并分泌大量的乳酸。MCTs參與各種單羧酸物質在細胞膜上的轉運，包括乳酸、丙酮酸和酮。腫瘤細胞通過MCTs將細胞內的大量乳酸跨膜轉移至細胞外，從而避免細胞內酸化導致的凋亡[6]。MCTs家族共包括14個成員，其中MCT1～4主要參與乳酸的轉運[7]。MCT4主要在糖酵解代謝中通過pH梯度參與乳酸的跨膜轉移[4]。本研究發現，MCT4在胰腺癌細胞上顯著異常表達，且與腫瘤最大徑、淋巴結轉移和TNM分期相關，是胰腺癌患者術后OS和PFS的獨立危險因子之一。

本研究中，MCT4在54.9%(208/379)的胰腺癌患者中呈現異常高表達，并且明顯高于周圍正常胰腺組織。缺氧是腫瘤細胞上調MCT4表達的主要機制，而胰腺癌是典型的乏氧性惡性腫瘤[8]，并且惡性程度隨著腫瘤最大徑的增加而加劇。本研究結果支持這一結論。既往研究證實，在多種惡性腫瘤中，MCT4異常表達后參與糖酵解代謝。例如，在肝癌細胞中，下調MCT4表達可抑制肝癌細胞的糖酵解代謝[9]。MCT4在存在糖酵解代謝負荷的胰腺癌(常較大或有淋巴結轉移)中更易異常表達。因此，MCT4可能是一些惡性腫瘤糖酵解代謝的特征指標之一。此外，MCT4異常表達還可通過導致癌細胞周圍酸性環境和誘導促炎分子釋放，參與形成促癌轉移的腫瘤微環境[10]。

綜上所述，MCT4異常表達可預測乳腺癌、肺癌和食管癌等多種惡性腫瘤患者的不良預后。本研究證實，MCT4異常表達的胰腺癌患者根治性切除術后復發時間和生存時間均較短。在肺癌細胞中，靶向MCT4的抑制劑可顯著下調乳酸轉運和糖酵解代謝水平，阻止細胞增殖與侵襲轉移[11]。同樣，MCT4表達的調控可促進胰腺癌細胞的侵襲與轉移[12]。因此，MCT4可作為監測胰腺癌患者術后預后的指標，同時可作為潛在的治療靶點，但還需要進一步證實。