七氟醚聯合N2O吸入麻醉對老年大鼠學習與記憶的影響

熊萬霞， 王 潔

復旦大學附屬中山醫院麻醉科，上海 200032

手術后出現的認知能力變化統稱為術后認知功能障礙，其最典型的表現為記憶力減退和學習能力下降，持續數月甚至數年。吸入麻醉劑如七氟醚、異氟醚、氧化亞氮(N2O)等誘導的神經毒性可能是發生術后認知功能障礙的原因之一[1]。由于大腦體積、神經遞質種類、代謝功能等方面的原因，老年患者對麻醉藥物引起的改變較年輕人更為敏感。

文獻[2]報道，高達10%的老年患者在術后3個月內出現持續性的認知功能障礙；當該癥狀持續超過6個月時，可視為并發長期認知功能障礙。首個國際多中心臨床研究(ISPOCD)[3]顯示，與非手術麻醉組相比較，手術麻醉組患者在術后1周、3個月及1～2年認知障礙的發生率分別為10.4%、10.2%和0.9%。該研究表明，術后認知功能障礙在很大程度上表現為可逆性，較少發展為持續性。

麻醉藥物對認知功能的影響取決于藥物的藥代動力學及藥效學。麻醉藥物作用時間越短，術后認知功能障礙持續時間也越短[4]。本課題組既往研究[5-6]已證實，七氟醚聯合N2O吸入麻醉可致老年大鼠短期學習與記憶功能障礙，且海馬區神經元細胞凋亡增加是其可能的機制之一。本課題采用1.3%七氟醚聯合50%N2O作為吸入麻醉藥(以50%O2為氣體載體)，吸入麻醉4 h，進一步探討七氟醚聯合N2O吸入麻醉對老年大鼠短期及長期認知功能的影響，并探討其海馬區神經毒性。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立及分組 選擇18月齡SD老年大鼠40只，質量250～300 g，隨機分為麻醉組(22只)和對照組(18只)。麻醉組給予1.3%七氟醚+50% N2O 吸入4 h，對照組給予 50%O2吸入4 h，流量均為3 L/min。用電熱毯維持大鼠直腸體溫在(37.0±0.5)℃。參考Culley等[7]的研究模型，使用多功能監護儀持續監測呼氣末CO2(ETCO2)和吸入麻醉深度(MAC值)。麻醉組予以氧飽和度儀監測氧飽和度(SpO2), 為避免應激，對照組不監測SpO2。麻醉過程中保留自主呼吸，持續觀察大鼠的呼吸頻率、肢端顏色和口唇顏色。所有大鼠均飼養于復旦大學附屬中山醫院動物實驗中心，自由飲水、攝食。飼養環境：12 h晝夜交替，室溫22 ℃，濕度60%。本研究通過復旦大學附屬中山醫院倫理委員會批準。

1.2 檢測方法 所有實驗大鼠建模48 h后進行連續6 d定航訓練，水迷宮實驗第7天進行第1次空間探索實驗，實驗結束后隨機抽取麻醉組6只及對照組6只大鼠用于免疫熒光檢測。其余大鼠在水迷宮實驗第14天行第2次空間探索實驗，結束后斷頭取腦用于分子生物學分析。

1.2.1 Morris水迷宮實驗 該實驗包括定位航行和空間探索實驗兩部分。定航訓練歷時6 d，每天將大鼠面向池壁，分別隨機從4個象限放入水中，共4次，通過攝像系統記錄并分析大鼠游泳軌跡，大鼠尋找平臺的最大時限設定為60 s，登臺5 s視為成功，攝像系統停止記錄。使大鼠在平臺停留15 s，以提供時間讓大鼠觀察周圍提示物，然后開始下一次訓練。若大鼠在60 s內未找到隱蔽平臺，攝像系統停止記錄，人為引導大鼠尋找到平臺并讓其在平臺上停留15 s。空間探索實驗分別在第7天和第14天進行。去掉隱藏平臺，任選除平臺象限外的兩個入水點將大鼠放入水池中，記錄其在60 s內的游泳軌跡。

1.2.2 TUNEL/NeuN免疫熒光雙標檢測凋亡情況 對取材的大鼠腹腔注射600 mg/kg水合氯醛，迅速切皮，進胸，暴露心臟，灌注0.9%氯化鈉液200 mL，先快后慢灌注4% 多聚甲醛 (PFA) 約300 mL，至大鼠四肢、尾巴僵硬，取出海馬組織。將腦組織置于4% PFA，4℃過夜。10%、20%、30%蔗糖梯度脫水，OCT包埋劑包埋，以20 μm連續冰凍切片，每隔100 μm取1片冰凍切片進行室溫干燥，用含0.5% Triton X-100和10%驢血清的0.01 mmol/L磷酸鹽緩沖劑(PBS)室溫封閉1 h。吸棄封閉液，加入一抗(NeuN，1∶500)，4℃冰箱孵育過夜；用含有5%血清的0.01 mmol/L PBS按1∶1 000稀釋二抗，37℃孵育2 h。按照TUNEL染色試劑盒說明進行TUNEL染色，用含5%血清的0.01 mmol/L PBS溶液稀釋的4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(1∶1 000)室溫避光孵育30 min，熒光淬滅劑封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.2.3 Western印記法檢測凋亡蛋白 取固體腦組織加入預冷的含PMSF的細胞蛋白裂解液，超聲震蕩后離心吸取上清。采用BCA法測定所提蛋白的濃度。取30 μg蛋白樣本于沸水中煮5 min，使蛋白變性后進行SDS-PAGE凝膠電泳，在300～350 mA恒流條件下轉入PVDF膜。隨后用含5%脫脂奶粉的封閉液在室溫條件下用搖床震蕩2 h。用特異兔抗鼠分裂caspase-3抗體(cleaved-caspase-3， 1∶1 000，Epitomics)、兔抗鼠Bax抗體(1∶500，Santa Cruz)、兔抗鼠cleaved PARP抗體(1∶500，Santa Cruz)在4℃條件下孵育過夜，以β-actin作為內參(1∶1 000，Santa Cruz)。洗膜后與二抗(HRP標記山羊抗兔IgG，Santa Cruz)在室溫孵育1 h，使用ECL高靈敏化學發光試劑盒進行顯影。對膠片進行曝光，并進行灰度值分析。

2 結 果

2.1 一般情況 麻醉過程中兩組大鼠生命體征平穩、未發現明顯缺氧(SpO2<90%)、二氧化碳潴留等，蘇醒快速、運動飲食如常。水迷宮訓練過程中未發現運動障礙、漂浮航行等。

2.2 老年大鼠短期認知功能的改變 結果(圖1)顯示：在連續6 d的定航訓練中，麻醉組大鼠游泳速度與對照組大鼠差異無統計學意義(P=0.9)。重復測量數據多因素方差分析顯示，麻醉組逃逸潛伏期在訓練后第4、5、6天較對照組顯著延長(P=0.023、P=0.049、P=0.005)。第1次空間探索實驗結果顯示，麻醉組在目標象限的路程百分比(P=0.017)和時間百分比(P=0.015)均顯著低于對照組。

圖1 吸入麻醉對老年大鼠短期(2～8 d)認知功能的影響

2.3 老年大鼠長期認知功能的改變 第2次空間探索實驗(圖2)顯示，兩組大鼠在目標象限游泳時間百分比(P=0.55)和路程百分比(P=0.62)差異均無統計學意義。

圖2 吸入麻醉對老年大鼠長期(15 d)認知功能的影響

2.4 海馬區神經細胞凋亡情況 結果(圖3)顯示：第1次空間探索實驗后TUNEL/NeuN免疫熒光共染結果(圖3A)顯示，麻醉組海馬CA1區TUNEL陽性細胞數較對照組明顯增加，同時神經元標志物NeuN表達下降，提示大鼠吸入麻醉后短期麻醉組海馬區存在神經元丟失。第2次空間探索實驗后Western 印跡結果(圖3B～3D)顯示，海馬CA1區TUNEL陽性細胞數較7天前明顯減少，但兩組間差異無統計學意義；兩組大鼠海馬區凋亡相關指標分裂caspase-3、Bax的表達量差異均無統計學意義(P=0.07、P=0.62)，DNA損傷指標PARP-1差異也無統計學意義(P=0.1)。

圖3 吸入麻醉對海馬神經元凋亡的影響

3 討 論

近年來，吸入麻醉藥所致的神經毒性及其與認知功能障礙的關系引起廣泛關注。N2O聯合異氟醚吸入全麻或70% N2O鎮靜能導致大鼠空間記憶能力長期損害[7]。高齡是目前唯一公認的導致長期或不可逆術后認知功能障礙的危險因子。隨著年齡的增長，認知功能以及大腦自身修復功能逐漸減退。本課題組前期研究[5-6]已證實，18月齡老年大鼠在七氟醚聯合N2O吸入麻醉后1周內出現空間學習與記憶受損。而本研究顯示，七氟醚聯合N2O吸入麻醉后在短期內(2～8 d)可致老年大鼠學習與記憶功能減退，支持本課題組前期研究結果；麻醉2周后，麻醉組與對照組大鼠在目標象限游泳時間百分比和路程百分比差異均無統計學意義，提示吸入麻醉后認知功能障礙存在可逆性。

神經炎癥是術后認知功能障礙的病理生理機制之一。動物模型已證實異氟醚、七氟醚以及手術創傷應激致外周炎癥因子表達量增加，血腦屏障通透性破壞，炎癥介質通過迷走神經通路進入中樞神經系統；同時，機體啟動膽堿能抗炎途徑，導致短期、可逆的神經炎癥反應，包括嗜睡和認知功能障礙[8-9]。另一方面，在體內和體外研究中，已發現臨床應用濃度的異氟醚、七氟醚和地氟醚可導致與阿爾茲海默癥相似的病理生理過程，導致神經元細胞凋亡[10-11]。

本課題組前期[5-6]已發現，老年大鼠吸入麻醉后48 h及第8天凋亡相關指標分裂caspase-3、Bax表達增加，出現短期空間學習與記憶功能障礙。本研究中，大鼠在第1次空間探索實驗后海馬CA1區TUNEL陽性細胞數較對照組明顯增加，同時神經元標志物NeuN表達下降，與前期研究[5]結果一致；而第2次空間探索實驗后兩組海馬區凋亡相關指標分裂caspase-3、Bax 以及DNA損傷指標PARP-1的表達量差異無統計學意義，且海馬CA1區TUNEL陽性細胞數較7 d前減少。以上研究結果證實，吸入麻醉致老年大鼠的神經毒性具有可逆性。本課題組前期研究[5-6]已證實，七氟醚聯合N2O吸入麻醉暴露致老年大鼠海馬區神經細胞凋亡的同時，反饋性引起內源性SIRT1的表達及p53去乙酰化增加。而DNA 損傷和氧化應激后，機體在啟動細胞凋亡途徑的同時，催化SIRT1對 p53的去乙酰化，從而抑制 p53介導的促凋亡相關基因的轉錄，起到自我修復與自我保護的負反饋作用[12]。

綜上所述，老年大鼠吸入麻醉后所致神經毒性具有短期及可逆性，可能與誘導神經元凋亡程序，同時啟動抑制促凋亡程序有關。本課題組將在接下來的研究中更深入探索吸入麻醉所致老年大鼠認知障礙及神經毒性的自我修復機制，為預防及治療術后認知功能障礙提供新思路。