基于可降解磁性生物支架的離體三維心肌補片構(gòu)建及其生物學(xué)特性分析

叢 碩， 王文碩， 楊 慧， 魏 來， 王春生

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院心外科，上海 200032

心肌梗死及其導(dǎo)致的心肌重構(gòu)和心衰長期以來是全球排名第一的致死因素[1-2]。嚴重的心肌缺血會造成大面積心肌細胞壞死，由于心肌細胞再生能力十分低下，最終可演變?yōu)樾牧λソ遊3]。近年來，雖然干細胞技術(shù)被應(yīng)用于心肌梗死的治療[4-6]。然而直接注射干細胞，存活率低且無法與原有心肌有效整合，難以維持穩(wěn)定的療效[7-8]。運用組織工程技術(shù)將干細胞先在體外復(fù)合于組織工程支架中，從而有效提高植入后干細胞的存活率，促進其與既有心肌建立血供聯(lián)系以形成有功能的整體，成為當(dāng)下重要的開拓性研究方向之一。

作為組織工程基本構(gòu)架的生物支架材料必須滿足生物相容性、可降解性、合適的厚度與良好的支撐性能等條件。這種材料首先需要具有合適的孔徑與良好的孔隙率，能夠為細胞生長提供足夠的空間，使附著生長的細胞能獲得充足的氧與養(yǎng)分輸送而提高存活率；同時需要有生物功能性親水表面，促進細胞黏附、增殖、分化，刺激細胞外基質(zhì)形成；還要具有較高的抗壓強度，表現(xiàn)出與自然心臟組織良好的生物機械適應(yīng)性[9]。

有研究[10]表明，殼聚糖作為一種堿性的天然多糖，具有良好的生物相容性、生物可降解性、內(nèi)在抗菌活性以及與生長因子結(jié)合的能力；而蘆薈膠已被多項實驗證明具有抑制凋亡、促進細胞增殖的作用[11]。二者結(jié)合，可作為一種較理想的支架材料植入體內(nèi)。此外，臨床試驗[12]證實，圍手術(shù)期補充鐵元素可以減少因失血所致的術(shù)后貧血的發(fā)生，并可以增強心臟搏出量和腎濾過率[13-14]。而對于急性心肌梗死的患者，增加血液循環(huán)中鐵元素含量可以明顯縮小心肌梗死面積并延緩左室重構(gòu)[15]。因此，本研究以磁性氧化鐵納米顆粒(iron oxide nanoparticles, IONP)、殼聚糖和蘆薈膠為原料合成新型磁性生物支架，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建離體三維心肌組織補片，探索其生物學(xué)特性，期望能為心肌梗死的移植物替代治療提供新的選擇。

1 材料和方法

1.1 磁性生物支架的制備 將0.6 g冰醋酸溶于100 mL純水中制得弱酸性溶劑；稱取1 g殼聚糖和0.2 g蘆薈提取物粉末，緩慢加入劇烈攪拌的溶劑中，至溶液呈半透明狀。通過溶劑熱法制得IONP[16]，并將其加入上述溶液中，形成質(zhì)量分數(shù)約為0.1%的磁性氧化鐵、1%的殼聚糖及0.2%的蘆薈黑色混合溶液。將上述混合溶液以固定速率于液氮中快速定型后，-50℃冷凍干燥48 h，制得磁性生物支架。使用前，用60Co輻照滅菌(25 kGy)。

1.2 力學(xué)性能表征 采用動態(tài)熱機械分析儀Q850測試多孔支架的拉伸強度。將制備的支架裁剪成5 mm×2 mm×30 mm的長方條，固定在測試臺上。以100～250 N的拉力，將樣品以1 mm/min速度沿軸線拉伸至斷裂。將所獲得數(shù)據(jù)制圖，獲得材料的彈性模量和彈性應(yīng)變極限。

1.3 孔隙率測試 將支架置于體積為V0的無水乙醇中，放入真空箱中，抽真空，記復(fù)合材料與乙醇的總體積為V1。移出支架并記錄剩下的無水乙醇體積為V2。支架的孔隙率(P)=(V0-V2)/(V1-V2)×100%。

1.4 體外降解實驗 將滅菌處理后的含有不同濃度蘆薈膠成分的多孔支架稱質(zhì)量，記為(Wi)。浸入5 mL 含有0.2 mg/mL膠原酶Ⅰ的PBS溶液，于不同時間取出支架，離心干燥稱質(zhì)量，記為 (Wf)。降解度(D)=[(Wi-Wf)/Wi]×100%

同時，用磁共振監(jiān)測不同時間點的含0.1% IONP的多孔支架(氧化鐵組)以及不含IONP的多孔支架(無氧化鐵組)的降解過程，并記錄影像。

1.5 支架細胞毒性測試 將上述多孔支架裁剪成5 mm×5 mm×2 mm大小，浸泡于3 mL含5%FBS的DMEM培養(yǎng)液中72 h，并收集浸出液。將等數(shù)量H9C2大鼠心肌細胞接種至RTCA計數(shù)培養(yǎng)板內(nèi)，加入支架材料浸出液200 μL培養(yǎng)(支架組)。用同樣置于37℃ 72 h的DMEM+5%FBS培養(yǎng)液培養(yǎng)的細胞作為對照。設(shè)定程序，實時監(jiān)測細胞48 h，觀察其貼壁密度以及增殖速率。將所得數(shù)據(jù)繪圖，比較兩組細胞毒性。

1.6 離體三維心肌補片的構(gòu)建 選取經(jīng)60Co滅菌后的多孔支架，裁剪成約5 mm×5 mm×2 mm大小(約1 g)，放置于底部直徑60 mm的低吸附細胞培養(yǎng)皿中。按4×105個/cm3密度，將分化至第21天的人心肌細胞接種到多孔支架上，并用含5%FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)7 d后，進行其他實驗。

1.7 三維補片形貌表征 將培養(yǎng)7 d的離體心肌補片置入2.5%戊二醛，4℃固定12 h；0.1 mmol/L PBS漂洗后，用1%鋨酸固定液固定1 h；用30%～100%乙醇梯度脫水；臨界點干燥、噴金后，掃描電鏡觀察并攝片。

1.8 收縮-舒張功能測試 將培養(yǎng)7 d的離體三維心肌補片置于兩電極之間，設(shè)定電極放電參數(shù)為40 mV、5 ms、0.2 Hz。記錄組織收縮-舒張影像，用ImageJ圖像分析軟件對影像進行分析，用Clampfit軌跡擬合軟件分析收集的數(shù)據(jù)，得出收縮-舒張曲線。

1.9 定量PCR 采用定量PCR方法分析支架組心肌補片與對照組心肌組織心肌細胞特異性基因及凋亡相關(guān)基因表達。按照TRIzol (Thermo Fisher Scientific, 美國)操作步驟提取補片及組織總RNA。使用ReverTra AceTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBA, 日本)逆轉(zhuǎn)錄后，用SYBR Green Realtime PCR Master MixTM試劑盒(TOYOBA, 日本)行定量PCR檢測。設(shè)計肌鈣蛋白T(cardiac troponin T, cTnT)、B型鈉尿肽(B-type natriuretic peptide, BNP)、心房鈉尿因子(atrial natriuretic factor, ANF)、B細胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2, Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax)特異性引物，序列見表1。以各目的基因與GAPDH表達量比值為目的基因相對表達量。各實驗重復(fù)3次。

表1 心肌細胞特異性基因及凋亡相關(guān)基因引物序列

2 結(jié) 果

2.1 磁性生物支架的表面特征及孔隙率 通過梯度冷凍干燥法制得的磁性生物支架材料表面結(jié)構(gòu)見圖1A，可見梯度冷凍干燥法使該材料表面具有有序且聯(lián)通性好的微米級孔，平均直徑為(78.5±1.0)μm，平均面積為(1.09±0.07)×104μm2。此外，從其局部放大圖可見孔壁上均勻分布有四氧化三鐵顆粒。通過乙醇替代法對用不同蘆薈質(zhì)量分數(shù)制得的支架進行孔隙率測試，發(fā)現(xiàn)所有多孔支架的孔隙率>92%，表明所獲得多孔支架內(nèi)部為聯(lián)通孔洞結(jié)構(gòu)；隨著制備溶液中蘆薈含量的增多，孔隙率存在升高趨勢(圖1B)，表明蘆薈成分的加入，使水分子分布更加均勻，凍干后進一步增強了支架的孔隙。

2.2 磁性生物支架的力學(xué)特性 通過動態(tài)熱機械分析儀測定不同質(zhì)量分數(shù)蘆薈制得的支架在干燥狀態(tài)下的機械拉伸強度及彈性拉伸應(yīng)變極限，結(jié)果(圖1C～1D)顯示：多孔支架的機械拉伸強度并未隨蘆薈含量變化而改變，均約0.3 mPa；但隨著蘆薈含量的增多，支架的彈性拉伸應(yīng)變極限量減小(P<0.05)，表明蘆薈成分的加入，影響了殼聚糖分子之間的氫鍵結(jié)構(gòu)強度，使得支架彈性降低。

圖1 磁性生物支架的物理表征

2.3 磁性生物支架的生物學(xué)特性 經(jīng)膠原酶Ⅰ模擬的體外生物降解測試結(jié)果(圖2A)顯示：含有0.2%蘆薈膠成分的磁性生物支架表現(xiàn)出更好的生物降解速率，第3天已降解超過80%，第7天達到(82.9±2.4)%；當(dāng)蘆薈膠成分≥0.4%時，降解速率過快，第2天就幾乎完全降解，無法固定稱質(zhì)量，提示復(fù)合支架的成分及結(jié)構(gòu)與生物細胞外基質(zhì)相似，使支架易被降解。磁共振(T2加權(quán)TSE序列影像，圖2B)顯示：隨著時間延長，氧化鐵組多孔支架由低信號逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榫|(zhì)的高信號；而無氧化鐵組多孔支架一直為均質(zhì)的高信號。

2.4 磁性生物支架的細胞毒性 以類型相似但增殖能力更強的大鼠心肌細胞(H9C2)代替人心肌細胞對支架材料的體外細胞毒性進行評估，結(jié)果(圖2C～2D)顯示：用支架的浸出液培養(yǎng)的H9C2細胞密度略高于對照組，倍增時間為(30.8±5.4)h，約為對照組的3/4，倍增速率優(yōu)于對照組，表明多孔支架對心肌細胞無顯著毒性作用，其析出成分反而能促進細胞增殖。

2.5 離體三維心肌補片的形貌特征及收縮-舒張功能 細胞與支架共培養(yǎng)7 d后，支架表面心肌細胞黏附穩(wěn)固、伸展良好，而支架孔隙也幾乎被遷移的心肌細胞填充；心肌細胞排列整齊，在細胞與細胞、細胞與支架之間已形成緊密的結(jié)構(gòu)，局部放大圖可見相鄰細胞間形成的緊密連接(圖3A)。在外加電場刺激下，三維心肌補片可產(chǎn)生有節(jié)律的收縮-舒張運動(圖3B)，表明構(gòu)建的三維心肌補片具有一定的生理功能。

2.6 離體三維心肌補片對心肌細胞成熟與細胞凋亡的作用 對培養(yǎng)7 d后的三維心肌補片(支架組)以及同時間培養(yǎng)的自然成簇的心肌細胞(對照組)進行比較，結(jié)果(3C)顯示：支架組心肌補片中心肌結(jié)構(gòu)特異性蛋白ANF的mRNA表達量是對照組的3.82倍(P=0.038 4)，心肌細胞成熟相關(guān)基因BNP和cTnT的mRNA表達水平分別為對照組的5.14倍(P<0.001)和3.24倍(P=0.003)，凋亡相關(guān)基因Bax/Bcl-2比例僅為對照組的0.44倍(P=0.012)。

圖2 磁性生物支架的生物學(xué)特性及毒性

3 討 論

成年人的心肌自我更新能力十分有限。心臟缺血性疾病發(fā)生后，缺血區(qū)域心肌細胞損傷或死亡，但周圍的心肌細胞無法分裂增殖，導(dǎo)致患者心力衰竭以致死亡。目前，基于干細胞的替代修復(fù)方法正越來越受到人們重視，其中組織工程心肌已成為最有希望的治療方案之一[17-18]。因此，構(gòu)建具有功能的組織工程心肌補片成為實現(xiàn)該目標(biāo)的研究重點。

生理條件狀態(tài)下，心肌細胞在由細胞外基質(zhì)及相鄰細胞形成的三維立體微環(huán)境中生長，與周圍細胞通過傳遞的化學(xué)、電以及物理機械等信號緊密聯(lián)系。因此，重建具有生理功能心肌組織的關(guān)鍵是構(gòu)建良好生物相容性的立體支架材料，為細胞提供多維空間，并同時促進心肌細胞成熟以及功能化[19]，這樣在未來才可用于組織移植，改善心肌梗死患者心臟功能。

支架的核心要素是孔隙和三維結(jié)構(gòu)。有研究[10]表明，50～100 μm的孔徑最適合心肌細胞生長及存活，支架的孔徑過大會影響內(nèi)皮細胞的遷移，從而阻礙血管化進程；孔徑過小則導(dǎo)致細胞沒有足夠的生長空間，同時會妨礙養(yǎng)料的運輸。本研究中的多孔支架以殼聚糖為骨架結(jié)構(gòu)，加入蘆薈成分，其活性基團具有強烈親水性，使水分子分布更加均一，進而使干燥后的支架孔徑均一，避免孔徑過大或過小[20]。此外，梯度冷凍使支架產(chǎn)生了有序的層狀結(jié)構(gòu)而表現(xiàn)出規(guī)則的三維結(jié)構(gòu)，為心肌細胞生長提供足夠的空間，并使心肌補片中的心肌細胞形成良好的偶聯(lián)，進而為細胞遷移及細胞間物質(zhì)交換提供便利條件，有利于提高附著心肌細胞的存活率，促進心肌細胞成熟，改善心肌補片的機械性能和力學(xué)強度[21]，提高體外培養(yǎng)的組織工程心肌補片的生理功能。

其次是生物相容性，由于殼聚糖本身就是一種天然的堿性多糖，結(jié)合蘆薈成分，使該支架具有良好的生物降解速率。但蘆薈成分也部分破壞了殼聚糖骨架間的氫鍵結(jié)構(gòu)，在使其降解速率加快的同時，也削弱了殼聚糖結(jié)構(gòu)的拉伸應(yīng)變能力[22]。蘆薈強烈親水特性使支架更有利于心肌細胞黏附，同時其釋放的微量因子具有促進心肌細胞新陳代謝、改善心肌收縮功能的作用。

隨著臨床研究者對生物安全性的考慮增加，植入支架的可視化及實時監(jiān)測也受到更多關(guān)注。氧化鐵材料已被10余年的臨床應(yīng)用證明在體內(nèi)具有良好的安全性[23-24]。該類材料通過體內(nèi)巨噬細胞的吞噬分解產(chǎn)生鐵離子，并最終進入機體鐵元素循環(huán)[25]。故本研究引入磁性四氧化三鐵納米顆粒，賦予該支架在磁場作用下特殊的響應(yīng)性，使其降解過程可用磁共振影像進行追蹤，結(jié)果表明，隨著降解的進行，該支架內(nèi)部的IONP不斷被分解或轉(zhuǎn)運流失，使其磁性強度發(fā)生變化，且與降解程度正相關(guān)。此外，有研究[26]表明，利用表面晶體生長的方法成功制備可降解復(fù)合氧化鐵支架，承載骨髓間充質(zhì)干細胞可以有效改善心肌梗死所致心臟泵血功能降低。因此，進一步研究將著重關(guān)注該組織工程心肌補片植入心肌梗死動物模型體內(nèi)后的安全性和有效性。

綜上所述，本研究應(yīng)用梯度冷凍干燥技術(shù)，成功制備了IONP-殼聚糖-蘆薈膠多孔支架，并以之構(gòu)建得到具有收縮-舒張生理功能的離體三維心肌補片。經(jīng)證實該磁性生物支架可有效促進心肌細胞增殖和功能成熟，克服了傳統(tǒng)細胞療法存在的細胞成活率低及不成熟等問題，為將其應(yīng)用于以心肌梗死為代表的缺血性心臟病的治療提供了基礎(chǔ)。