過敏性哮喘患者高遷移率族蛋白1、Th1/Th2細胞亞群及相關(guān)細胞因子表達分析

郝 艷， 鄭洪亮

沈陽市第七人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，沈陽 110003

哮喘是常見的慢性非傳染性疾病之一，全世界約有3.34億人受其影響。自我報告或經(jīng)醫(yī)生診斷的成人哮喘在全球占4.3%，各國之間存在很大差異[1]。近年來，哮喘患病率在許多發(fā)達國家穩(wěn)定或下降，但在發(fā)展中國家隨著生活方式改變而迅速升高。長期接觸過敏原，如病毒、煙霧、大氣污染物和環(huán)境污染物，會增加患哮喘的風(fēng)險[2]。哮喘的發(fā)病機制十分復(fù)雜，具有異質(zhì)性，其病理基礎(chǔ)為氣道炎癥，中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞在其中起重要作用。輔助T淋巴細胞2(Th2)細胞能合成高水平的白細胞介素(IL)-4、IL-5和IL-13，導(dǎo)致過敏原特異性免疫球蛋白(Ig) E的產(chǎn)生和肥大細胞釋放介質(zhì)[3-5]。Th1細胞通過分泌干擾素(IFN)-γ抑制Th2免疫反應(yīng)。因此，判斷IgE的產(chǎn)生和Th1/Th2細胞因子的平衡是評價哮喘的重要工具。本研究對過敏性哮喘患者Th亞群進行分析，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018年1月至2019年9月于我院呼吸內(nèi)科診治的98例哮喘患者，男性49例，女性49例，年齡25～70歲，平均年齡(42.9±12.5)歲。按照2015版全球哮喘防治創(chuàng)議(global initiative for asthma，GINA)方案，將患者分為輕度組(n=31)、中度組(n=33)、重度組(n=34)。隨機選擇同期體檢健康者為對照組(n=30)。組間年齡、性別等一般資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性。

1.2 CD4+IFN-γ+T細胞、CD4+IL-4+T細胞百分比測定 采集受試對象外周血2.4 mL，肝素抗凝，用PBS稀釋成 4 mL，混勻，然后沿試管壁緩慢加入4 mL 淋巴細胞分離液Ficoll到液面之上，并保持清晰的分層狀態(tài)。室溫(18～20℃)離心 2 000r/min 30 min。離心后可見試管內(nèi)的血液清楚地分為4層，上層為血漿層，中層為分離液層(單個核細胞處于血漿層和分離液層中間)，底層為紅細胞層，紅細胞層上為粒細胞層。用吸管將上層與中層之間的單個核細胞吸出收集到另一試管中，用0.9%氯化鈉液洗 2 遍，每次以 1 500r/min離心 10 min，棄上清后即得到高純度的單個核細胞懸液。單個核細胞懸液經(jīng)佛波酯(PMA)和離子霉素刺激后，與CD4、IFN-γ、IL-4抗體(R&D；編號分別為FAB3791R-025、MAB285-SP、BAF204)室溫孵育45 min，加入PBS洗滌、重懸，用Beckman Coulter Navios進行流式細胞檢測。

1.3 高遷移率族蛋白-1 (high mobility group protein-1，HMGB-1)、IFN-γ、IL-4和IL-5測定 采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)試劑盒(R&D)檢測 HMGB-1、IFN-γ、IL-4和IL-5(抗體編號分別為MAB1690-SP、DIF50、M4000B、M5000)表達，步驟均按照說明書，使用SynergyTMHT酶標儀(BioTek)在405 nm波長處檢測吸光度值。

1.4 肺功能 觀察并記錄受試者第1秒用力呼氣容積(FEV1)。

2 結(jié) 果

2.1 受試者一般資料 兩組年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)等無明顯差異；哮喘組血清IgE明顯升高，F(xiàn)EV1明顯降低(P<0.05，表1)。

表1 哮喘組患者與健康者基線資料

2.2 CD4+IFN-γ+T細胞、CD4+IL-4+T細胞百分比 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果(圖1)顯示：3組哮喘患者CD4+IFN-γ+T細胞低于對照組(P<0.05)；哮喘患者CD4+IL-4+T細胞高于對照組(P<0.05)。重度組患者CD4+IFN-γ+T細胞、CD4+IL-4+T細胞百分比與輕、中度組患者差異有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 HMGB-1、IFN-γ、IL-4和IL-5表達水平 結(jié)果(圖2)顯示：哮喘患者HMGB-1、IL-4和IL-5表達水平明顯高于對照組(P<0.05)，IFN-γ表達水平明顯低于對照組(P<0.05)；重度組HMGB-1、IL-4和IL-5表達水平明顯高于輕、中度組(P<0.05)，而IFN-γ表達水平明顯低于輕、中度組(P<0.05)。

2.4 HMGB-1、IFN-γ、IL-4和IL-5與肺功能的相關(guān)性 Spearman分析結(jié)果表明，HMGB-1、IL-4水平與肺功能負相關(guān)(r=-0.568,P<0.05；r=-0.572,P<0.05)，IFN-γ水平與肺功能正相關(guān)(r=0.685,P<0.05)，IL-5與肺功能無相關(guān)性(r=-0.258,P>0.05)。

圖1 流式細胞術(shù)分析CD4+IFN-γ+T細胞、CD4+IL-4+T細胞百分比

圖2 ELISA分析HMGB-1、IFN-γ、IL-4和IL-5表達水平

3 討 論

CD4+T細胞在哮喘患者機體控制炎癥過程中起著至關(guān)重要的作用[6]。Th1、Th2、調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)、Th17和濾泡輔助T細胞及其相關(guān)的細胞因子如IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-10、IL-17和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等均參與哮喘病理過程[7-9]?？乖せ畹腃D4+T細胞可分化為效應(yīng)細胞，即Th1和Th2細胞。Th1細胞分泌IL-2、IFN-γ、淋巴毒素，而Th2細胞分泌IL-4、IL-5和IL-6[10]。Th2極化免疫反應(yīng)參與哮喘的發(fā)生發(fā)展，而Th2細胞分泌的IL-4和IL-5在啟動和維持哮喘反應(yīng)中起重要作用。另一方面，由Th1細胞產(chǎn)生的IFN-γ可以預(yù)防過敏性哮喘[11]。本研究中，與對照組相比，哮喘患者Th1(CD4+IFN-γ+)細胞及其細胞因子IFN-γ表達水平明顯降低，而Th2(CD4+IL-4+)細胞和其細胞因子IL-4、IL-5表達水平則明顯升高。除此之外，IL-4、IFN-γ表達水平與疾病嚴重程度有相關(guān)性，疾病程度越嚴重，IL-4表達越高而IFN-γ表達越低。

HMGB1是哺乳動物細胞核中的轉(zhuǎn)錄因子。在炎癥狀態(tài)下，HMGB1可通過活化的巨噬細胞、自然殺傷細胞(NK細胞)和樹突狀細胞等分泌到細胞外環(huán)境中。既往研究表明，在膿毒癥、急性肺損傷和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等急慢性炎癥患者的血清中存在HMGB1，推測HMGB1可能是炎癥中啟動先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)[12-14]。然而，HMGB1在過敏性哮喘中的確切作用尚不清楚。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)HMGB1在急性哮喘患者痰和血漿中異常表達[15]，是兒童過敏性哮喘的敏感生物標志物。本研究中，哮喘患者HMGB1表達明顯高于對照組，而且與疾病嚴重程度正相關(guān)。

綜上所述，本研究通過分析不同嚴重程度的哮喘患者以及健康成人外周血中Th1/Th2細胞和其相關(guān)細胞因子以及HMGB-1水平，發(fā)現(xiàn)過敏性哮喘患者血清中Th1/Th2失衡，HMGB1表達異常升高；HMGB-1、IL-4水平與病情嚴重程度密切相關(guān)，對臨床治療具有一定的評估作用。