神經源性高血壓小鼠差異靶基因分析
——基于GEO數據庫數據挖掘

劉鎳 蘇文淵 覃輝 何博 胥勇 劉信 羅曉舟 唐純志 羅倫

(成都市第二人民醫院 1康復醫學科，四川 成都 610000;2骨外科;3廣州中醫藥大學)

越來越多的證據顯示，交感神經活動增加在高血壓的早期具有明顯相關性。神經-心血管調控機制的異常是神經源性高血壓的主要特征。心血管舒縮、心臟交感神經興奮性增強及副交感神經的降低是神經-心血管調控機制異常的主要原因〔1～3〕。在自發性高血壓大鼠的研究中提示，幼鼠的腦干和下丘腦中申訴水平的升高對其成年后動脈壓和壓力感受器的反射具有激活效應〔4～7〕。交感神經的興奮不僅可以引發高血壓，還可以將其維持在一個較高的水平。從Pubmed檢索以神經源性高血壓為題目的研究可以看出，從2008年的33項到2017年的61項，關于本病的文章逐年升高，本病已成為學界研究熱點之一。本研究旨在研究神經源性高血壓小鼠下丘腦的基因組學差異靶基因，以期為臨床開發本病治療藥物拓展新的思路。

1 資料與方法

1.1資料來源 利用NCBI中GEO數據庫查詢下載GSE25076〔8〕基因芯片數據。

1.2方法 在NCBI提供的GEO2R平臺內檢索GSE25076，將全部數據下載保存為Excel格式，并進行差異基因分析。采用DAVID平臺進行基因本體論(GO)分析，京都基因與基因組百科全書(KEGG)平臺進行KEGG通路分析，STRING平臺進行蛋白質互作網絡(PPI)分析。除基因互作網絡圖外，其余圖片均由R信號2.1.5制作。

2 結 果

2.1差異基因選取條件及結果 在GEO2R平臺內對BPH/2J小鼠下丘腦基因芯片數據(n=6)和正常血壓BPN/2J小鼠下丘腦基因芯片數據(n=6)進行分析，共獲得34 760個差異基因，火山圖如圖1所示。以|logFC|>1.5、P<0.05為篩選標準對所有基因進行篩選，最終獲得28個符合上述條件的基因。如表1所示。使用R信號V 3.5.1 plot程序包生成層次聚類熱圖，如圖2所示。聚類結果很好地將兩組小鼠加以區分。

2.2基因本體分析(GOEA) GOEA被用于在基因或基因產物列表中篩選基因本體的過度表達，以便了解它們的生物學意義。來自世界各地的基因本體聯盟(GOC)〔7〕。成員合作開發GO，它是一種用于描述跨多個物種的基因產物的生物學過程，細胞組分和分子功能的資源。在DAVID平臺錄入上述60個基因后篩選P<0.05的GO條目，如表2所示。結果在生物學過程方面得到的28個差異基因富集在磷脂分解代謝過程〔甘油磷酸二酯磷酸二酯酶結構域(GDPD)3,IVE組磷脂酶A2(PLA2G4E)〕。分子功能方面多表現為水解酶活性〔真核翻譯起始因子(EIF)4A3,自噬相關半胱氨酸肽酶(ATG)4A,鹵代酸脫鹵酶樣化解酶結構域(HDHD)3,核糖核酸酶(POP4),GDPD3,PLA2G4E〕。

2.3KEGG通路富集分析 將上述60個基因進行KEGG分析，以Bonferroni法對結果進行統計學分析，發現僅RNA轉運通路具有統計學顯著性。相關基因有EIF4A3、POP4兩個。

2.4差異基因的相互作用分析 將上述28個差異基因錄入STRING數據庫，在去除渙散鏈接基因后，總共篩選出25個基因。這25個基因是已被證實或STRING預測其具有相互作用的基因。互作網絡圖如圖3所示。通過觀察可知，處于節點位置且鏈接數目最多的基因是Rps9、Rps16、Fau、Rps11、Rbm8a、Eif4a3、Pop4、Slc25a31等。

圖1 火山圖

表1 差異基因列表

續表1 差異基因列表

圖2 差異基因熱圖

表2 GO分析結果

圖3 差異基因互相作用網絡

3 討 論

GSE25076數據是采用Affymetrix Mouse Gene 1.0 ST Array平臺，鑒定26周齡BPH/2J高血壓小鼠和正常BPN/2J小鼠下丘腦中的基因表達譜。

下載數據集后，通過設定篩選條件，我們最終得到28個差異基因。其中12個在神經源性高血壓小鼠中表達下調，16個表達上調。通過聚類分析，這28個差異基因很好地將兩組小鼠聚為兩類。GO分析和KEGG通路富集分析結果表明：在GO分析方面，鑒定出的差異基因在磷脂分解代謝過程、水解酶活性調節等過程發揮著重要作用。KEGG通路富集結果表明RNA轉運通路可能是本病發病機制中有著關節作用的細胞信號轉導通路。基因互作(PPI)分析結果表明，28個差異基因中有13個具有互相作用。

取GO富集條目、KEGG通路富集結果和蛋白質互作網絡PPI相連節點的交集，得到EIF4A3,POP4兩個基因。可推測這兩個基因可能在BPH/2J小鼠高血壓發病機制中有著重要地位。

真核翻譯起始因子(EIF)4A3已被證明其表達下調將會導致胚胎發育過程中神經脊細胞遷移/分化和神經干細胞凋亡，與Richieri-Costa-Pereira綜合征顱骨缺損和小頭畸形有著密切關聯〔9,10〕。雖然目前其具體機制尚不明晰，但不可否認的是其在神經發育過程中有著重要作用。EIF4A3編碼DEAD-box解旋酶，它是RNA結合外顯子連接復合物(EJC)的核心組成部分，它控制轉錄后事件，包括選擇性剪接，非有義介導的mRNA衰變，翻譯起始和RNA定位〔11〕。除了胚胎神經發育之外，越來越多的證據表明其在神經元細胞軸突生長、突觸形成中也有著重要地位。EIF4A3與海馬神經元樹突中信使核糖核蛋白(mRNP)復合物中的UPF1有關〔12〕。Eif4a3或Upf1的缺失導致Arc的積累并增加微型興奮性突觸后電流(mEPSC)的幅度，這與Arc在AMPA受體運輸中確定的作用一致〔13〕。另一項研究表明Eif4a3在大鼠新環境探索的背景下進行弧調節，該研究認為Eif4a3與空間學習相關〔14〕。

核糖核酸酶(POP)4，是脊椎動物特異性的分泌性核糖核酸酶〔15〕。核糖核酸酶4是不同脊椎動物物種中最保守的基因〔16〕。不同脊椎動物物種的氨基酸同源性高達94%〔16〕。POP4具有非常嚴格的底物特異性-強烈傾向于在切割位點的3′側使用尿苷〔17〕。POP4蛋白不僅具有血管生成，還具有神經源性和神經保護作用，在體外，離體和體內測定中誘導血管生成。誘導小鼠胚胎干(ES)和胚胎癌細胞的神經球形成和神經元分化，刺激小鼠胚胎皮質神經元的神經絲形成并防止應激誘導的變性。血管生成和神經發生在解剖學和形態學上密切相關〔18〕。神經和血管系統是平行發展的，它們之間存在高度的串擾。血管和神經被引導到他們的目標，并且經常并排追蹤〔19〕。血管和神經共享許多共同的原則和信號，用于形成模式和生存。已經發現調節神經發生的分子和信號也調節血管生成。例如，semaphorin-plexin系統在血管生成和神經發生中具有重要作用〔20〕。

綜上所述，EIF4A3和POP4最為可能是神經源性高血壓發生的基因層面的原因，通過RNA轉運通路，影響神經發育、血管生成及神經發生等過程，最終導致本病的發生發展。但需要說明的是，關于這兩種基因在分子層面的具體作用機制，上下游調節信號尚且還不明晰，有待進一步研究。