尿毒清顆粒對單側輸尿管梗阻大鼠腎間質纖維化及腎功能和轉化生長因子-β1表達的影響

韓宇鵬 孟慶云 楊舒賀 楊松

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154002)

各種慢性腎臟疾病(CKD)中腎臟纖維化(RIF)是進展為終末期腎衰竭(ESRD)的一種病理損傷過程，其特征病理變化主要包括腎小管間質炎癥和纖維化、腎小管萎縮和擴張及腎小球硬化等〔1～4〕。研究顯示，影響CKD預后中腎小管間質損傷嚴重程度是決定因素〔5～7〕。分析RIF的相關發病機制及研發抗腎間質纖維化的藥物，對于控制CKD具有重要意義。本文研究旨在探討尿毒清顆粒對單側輸尿管梗阻(UUO)大鼠腎間質纖維化及腎功能和轉化生長因子(TGF)-β1表達的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料 清潔級雄性Wistar大鼠90只，體質量(150±10)g，適應性飼養1 w，實驗動物每天予以12 h光照，飼養溫度(22±2)℃，相對濕度(55±2)%。動物飼料、墊料、飲用水均已消毒，大鼠來源于佳木斯大學實驗動物中心。

1.2實驗分組及UUO模型制備 按照隨機數字法分為假手術組、模型組、實驗組各30只。模型組和實驗組行左側輸尿管結扎術，均于無菌條件下進行，給予(0.3～0.4)ml/100 g的10%水合氯醛進行腹腔內注射麻醉，于大鼠背部，左側肋腰點下0.5 cm左右及脊柱左側1 cm左右做一1.5～2.0 cm的縱向切口，逐層進腹，大鼠腎臟充分暴露。將腎下及部分包膜和腎蒂處包膜用小彎鑷輕輕剝離，將大鼠輸尿管分離出，分別在遠離腎盂1 cm左右處及緊靠腎盂處應用“0”號絲線結扎輸尿管，并且于兩結中間將輸尿管剪斷，對大鼠腹腔用慶大霉素生理鹽水沖洗，檢查若無出血和滲漏后將腹膜腔各層及背部皮膚逐層縫合，常規消毒，覆蓋無菌鋪巾。其中假手術組手術除不剪斷及不結扎輸尿管外，其余操作同模型組和實驗組。

1.3給藥方法 實驗組給予尿毒清顆粒每日2 g/kg灌胃，假手術組與模型組灌胃等劑量生理鹽水，每日1次，連續14 d。各組于手術后第14天處死，留取左側梗阻腎標本。

1.4腎組織病理光鏡檢測 取大鼠左腎組織，應用甲醛固定后石蠟包埋切片，將其切成3 μm切片后行蘇木素-伊紅(HE)。HE染色觀察腎小管間質細胞浸潤及病理改變，半定量分析腎臟間質纖維化。

1.5腎功能指標測定 采集大鼠下腔靜脈血，經1 500 r/min離心5 min后取血清，采用全自動生化分析儀，檢測血尿素氮(BUN)和血肌酐(Scr)水平。

1.6血清TGF-β1表達 取1.5血清標本，采用酶聯免疫吸附試驗測定血清TGF-β1水平。

1.7腎組織中TGF-β1表達 所有腎組織標本按常規固定、脫水、透明、石蠟包埋，切片4 μm。將切片脫蠟，熱抗原修復，分別滴加一抗兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體(1∶120)。4℃孵育過夜,滴加二抗，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染細胞核，每次染色均以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對照，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。采用免疫組織化學法測定TGF-β1表達，以胞質出現棕黃色顆粒為陽性，測定TGF-β1陽性面積。

1.8統計學方法 運用SPSS22.0軟件統計進行t、F檢驗。

2 結 果

2.1各組組織病理表現比較 假手術組腎組織形態結構基本正常；模型組第14天時發生間質增寬、間質炎細胞浸潤、腎小管萎縮及RIF表現；實驗組RIF程度明顯減輕。見圖1。

2.2各組腎功能變化比較 模型組和實驗組BUN和Scr表達、血清及腎臟組織TGF-β1表達顯著高于假手術組，且實驗組顯著低于對照組(P<0.05)。見表1。

圖1 各組腎臟組織纖維化表現(HE，×200)

表1 各組腎功能變化、血清及腎臟組織TGF-β1表達比較

3 討 論

目前已知的腎間質纖維化機制包括：腎小管上皮細胞轉分化、腎間質成纖維細胞活化與增殖、細胞外基質轉換失平衡、腎組織局部缺氧缺血〔7，8〕。腎小管上皮細胞轉分化在腎小管間質纖維化中扮演重要角色。在腎損傷過程中，多種因子誘導上皮細胞部分轉化為成纖維細胞，若及時干預則能恢復上皮細胞的完整性，阻斷腎小管上皮細胞轉分化的發生〔9～11〕。目前，對腎小管上皮細胞轉分化在腎間質纖維化發生發展中的重要性仍缺乏全面認識。

尿毒清顆粒作為一種中成藥，組成主要包括黃芪、黨參、制何首烏、制大黃、白術、車前草、茯苓、丹參、川芎、姜半夏等，其中黃芪和黨參具有益氣健脾功效，制何首烏具有益精補腎功效，共奏益腎健脾功效；制大黃具有通腑泄濁功效，可使濕濁之邪由大便排出，白術具有除濕健脾功效，車前草和茯苓具有除濕利尿功效，姜半夏具有降逆止嘔、燥濕何種功效，共奏通腑降濁功效；丹參和川芎具有活血化瘀功效。縱觀全方可奏通腑降濁、活血化瘀和健脾利濕功效。現代藥理研究表明，尿毒清顆粒可以改善患者的氮質水平，降低腎組織代謝水平，健脾利濕，活血化瘀，不良反應小，達到較好臨床效果〔12，13〕。程錦繡等〔14〕實驗證實尿毒清顆粒可提高慢性腎衰竭大鼠生存質量，降低Scr、BUN水平，其機制與調節TGF-β1通路有關。此外，劉新輝等〔15〕實驗證實黃芪甲苷可保護TGF-β1誘導的腎小管上皮細胞間充質轉分化,其機制可能與增加線粒體生物合成有關。本研究表明，尿毒清顆粒可減輕腎間質纖維化；模型組和實驗組BUN和Scr表達高于假手術組，且實驗組低于對照組，由此可見尿毒清顆粒可改善腎功能。

TGF-β是腎間質纖維化過程中最重要的生長因子之一，在腎間質纖維化發生、發展的多個環節起作用〔16〕。TGF-β1是TGF-β家族中的一員，是纖維化的關鍵因子，可通過促進腎臟細胞肥大、腎臟的免疫調節和細胞外基質的生成來介導腎小球硬化〔17，18〕。TGF-β1被認為是上皮細胞-間充質轉化過程的主要誘導因子。

綜上，尿毒清顆粒可減輕UUO大鼠腎間質纖維化，改善腎功能及降低TGF-β1表達。