連翹三萜類化合物對肝癌細胞增殖、凋亡及放療敏感性的影響

張紅

(武漢市中西醫結合醫院藥學部，湖北 武漢 430022)

肝癌是我國發病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一，其發病因素較多〔1，2〕。治療手段仍以手術為主，同時結合放化療綜合治療，但手術有不完全、易復發的隱患，放化療會使細胞產生對其不敏感性，難以清除癌細胞〔3〕。近些年出現的以中藥為主中西醫結合治療的方式對肝癌的治療有較好療效〔4〕。中藥有直接殺傷癌細胞、抑制肝癌細胞增殖、誘導癌細胞凋亡、調節和保護機體免疫、預防肝癌轉移復發和病變等作用〔5〕。連翹三萜類化合物具有抗菌消炎、抗癌、抗病毒和抗氧化等作用〔6〕。研究發現連翹乙醇提取物可以抑制BGC-823細胞增殖、促進凋亡的作用〔7〕。連翹三萜類化合物樺木酸能通過誘導黑色素瘤細胞凋亡，抑制腫瘤的發生〔8〕。連翹三萜類化合物安博立酸通過使細胞阻滯于S期并誘導細胞凋亡抑制人胃癌SGC-7901細胞的生長〔9〕。連翹三萜類化合物達瑪-24-烯-3β-乙酰氧基-20s-醇(DM)也能抑制人胃癌細胞的生長〔10〕。本研究擬分析連翹三萜類化合物對肝癌細胞增殖、凋亡及放療敏感性的影響及其可能的作用機制，為肝癌的預防和藥物治療提供實驗依據及新靶點。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 肝癌HepG2細胞購自中國科學院上海細胞庫。胎牛血清(FBS)、DMEM培養(美國Gibco)；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒(日本Takara)；PCR擴增儀(德國Eppendorf公司)；Taq DNA Polymerase、AceQ qPCR SYBR?Green Mix(南京vazyme)；細胞板、酶標儀、流式細胞儀、硅膠層析柱(賽默飛公司)；LipofectamineTM 2000轉染試劑盒(美國Invitrogen)；四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)；Western印跡試劑盒(上海信裕生物技術有限公司)；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙錠(PI)試劑盒(上海碧云天)；倒置顯微鏡(美國Olympus)；Co60醫療照射裝置(中國核動力研究院)。

1.2連翹三萜類化合物DM的提取 參考孫婧等〔10〕方法，將干燥的連翹果實粉碎，于95%的乙醇中浸泡成膏，再用乙酸乙酯萃取，然后用硅膠層析柱層析，最后用石油醚和乙酸乙酯混合液分次洗脫即可。所得混合物在旋轉蒸發儀中蒸干，再真空干燥箱40℃過夜，粉末狀保存。以50 nmol/L的濃度溶于二甲基亞砜(DMSO)中保存，使用時按所需濃度按比例稀釋。

1.3細胞培養 肝癌HepG2細胞常規培養于含10% FBS的DMEM培養基，置于37℃，含5% CO2恒溫箱培養。每2～3 d傳代一次。

1.4細胞轉染和分組 參考孫婧等〔10〕的研究方法，取對數生長期細胞消化后，接種于96孔板(1×104個/孔)培養，DMEM培養液培養24 h后，吸去原培養液，換成不同濃度DM(0、25、50、75、100 μmol/L)的DMEM培養液，分別繼續培養24、48、72 h。取常規培養的肝癌HepG2細胞消化后接種于96孔板中，待細胞生長至80%融合，更換為無血清培養基同步化12 h，隨后進行轉染。轉染分為si-NC組(轉染si-NC)、si-己糖激酶(HK)2組(轉染si-HK2)、DM+pcDNA組(DM 75 μmol/L處理+轉染pcDNA)、DM+pcDNA-HK2組(DM 75 μmol/L處理+轉染pcDNA-HK2)，轉染按照LipofectamineTM2000試劑盒進行操作。

1.5MTT法測定細胞增殖 取各組細胞培養到規定時間后，每孔加入20 μl質量濃度為5 g/L的MTT試劑，繼續孵育4 h，加入150 μ DMSO，震蕩混勻，在酶標儀測定各孔490 nm波長處OD值。每組設3個復孔取均值，將對照組細胞抑制率設定為0%。其余各組細胞抑制率(%)=(空白對照組OD值-實驗組OD值)/空白對照組OD值×100%。

1.6qRT-PCR分析HK2 mRNA表達水平 按照Trizol說明書提取總RNA，用反轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA，按照AceQ qPCR SYBR?Green Mix說明書進行qRT-PCR方法擴增。循環條件為95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個循環；60℃延長5 min。相對表達量采用2-△△Ct法計算。

1.7Western印跡檢測HK2蛋白表達 提取各組細胞蛋白，用BCA 蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。各組蛋白上樣量60 μg，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后，經電轉將蛋白轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉90 min，分別加入相應的一抗，4℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，每次5 min；再加入相對應的二抗室溫孵育2 h，PBS洗滌3次，每次10 min，暗室中顯影，定影。采用Quantity One凝膠分析軟件處理，測定各組蛋白條帶的吸光度，以目的條帶和β-actin條帶的比值作為蛋白表達水平。

1.8流式細胞術檢測細胞凋亡 用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化細胞，離心收集各組細胞，PBS漂洗2次，加結合緩沖液重懸細胞。依據試劑盒說明書，先后加入Annexin V-FITC和PI避光孵育。流式細胞儀檢測激發波長488 nm和發射波長530 nm處的熒光強度。實驗重復3次。

1.9細胞克隆集落形成實驗 取對數生長期HepG2細胞消化后，以合適密度接種于直徑為60 mm的培養皿中，細胞融合達到80%左右，分為對照組、DM組、si-NC組、si-HK2組、DM+pcDNA組、DM+pcDNA-HK2組，DM組、DM+pcDNA組、DM+pcDNA-HK2組分別加入75 μmol/L的DM，其余組不加藥，加藥24 h后，以上各組分別給予0、2、4、6、8 Gy的60Co醫療裝置照射。照射后，按照射劑量大小分別以0.3×103、1×103、1×103、3×103、3×103的細胞密度接種于60 mm的培養皿中，繼續培養10～14 d。PBS清洗2遍后甲醇固定15 min，吉姆薩染色30 min，在低倍光學顯微鏡下計數>50個細胞的集落。克隆形成率(PE)=克隆數/接種細胞數×100%，存活分數(SF)=照射劑量組的集落數/(該組細胞接種數×未照射組PE)。采用單擊多靶模型擬合細胞存活曲線，SF=1-(1-e-D/D0)N，Dq=D0×lnN。其中D為照射劑量(Gy)，D0為平均致死劑量，Dq為準閾劑量(代表存活的寬肩度)，N為外推值。放射增敏比(SER)=單純照射組D0/加藥聯合照射組D0。

1.10統計學分析 采用SPSS20.00軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1不同DM濃度對肝癌HepG2細胞增殖的影響 MTT法檢測結果顯示，用不同濃度DM處理肝癌HepG2細胞后，于24、48、72 h時檢測細胞增殖，肝癌HepG2細胞的抑制率隨著DM濃度的升高而逐漸顯著升高(P<0.05)。選用作用時間48 h，抑制率為50%左右的濃度(75 μmol/L)進行后續實驗。見表1。

表1 不同濃度DM對肝癌HepG2細胞抑制率的影響

2.2DM對肝癌HepG2細胞凋亡的影響 流式細胞儀檢測結果顯示，相較于對照組〔(6.79±0.58)%〕，DM組中HepG2細胞凋亡率〔(23.49±2.14)%〕顯著升高(t=13.046,P=0.000)。

2.3DM對肝癌HepG2細胞放療敏感性的影響 細胞克隆形成實驗后，通過單擊多靶模型擬合計算得出，在HepG2細胞中對照組和DM組D0值分別是2.531、1.353，Dq為1.848，0.739 Gy，N為2.075、1.726，DM組SER是1.870。細胞的存活擬合曲線如圖1所示，在同一劑量照射下，DM聯合照射組的存活率明顯小于單純照射對照組，細胞的存活曲線明顯下移；且隨著照射劑量的增加，曲線下移的趨勢呈現直線型。可見，DM對肝癌HepG2細胞具有輻射增敏作用。

與對照組比較：1)P<0.05圖1 不同劑量照射后HepG2細胞的存活曲線

2.4DM對肝癌HepG2細胞凋亡中HK2表達的影響 Western印跡檢測結果顯示，與對照組相比，DM組HK2蛋白表達水平顯著下降(P<0.05)。 qRT-PCR檢測結果顯示，與對照組相比，DM組HK2 mRNA表達水平顯著下降(P<0.05)。見圖2，表2。

圖2 HK2蛋白表達

表2 DM對肝癌HepG2細胞凋亡中HK2表達的影響

2.5抑制HK2表達對肝癌HepG2細胞增殖、凋亡及放療敏感性的影響 Western印跡檢測結果顯示，與si-NC組相比，si-HK2組HK2蛋白表達水平顯著下降(P<0.05)；MTT法和流式細胞儀檢測結果顯示，si-HK2組HepG2細胞抑制率和凋亡率顯著高于si-NC組(P<0.05)。見表3，圖3。細胞克隆形成實驗后，通過單擊多靶模型擬合計算得出，在HepG2細胞中si-NC組和si-HK2組D0值分別是2.596、1.452，Dq為1.888、0.775 Gy，N為2.069、1.705，si-HK2組SER是1.788。細胞的存活擬合曲線如圖4顯示，在同一劑量照射下，si-HK2聯合照射組的存活率明顯小于單純照射si-NC組，細胞的存活曲線明顯下移；且隨著照射劑量的增加，曲線下移的趨勢呈現直線型。

表3 抑制HK2表達對肝癌HepG2細胞增殖、凋亡的影響

圖3 HK2蛋白表達

與si-NC組比較：1)P<0.05圖4 不同劑量照射后HepG2細胞的存活曲線

2.6HK2過表達逆轉了DM對肝癌HepG2細胞增殖、凋亡及放療敏感性的作用 Western印跡檢測結果顯示，與對照組相比，DM組HK2蛋白的表達水平顯著下降(P<0.05)；相較于DM+pcDNA組，DM+pcDNA-HK2組HK2蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。MTT法檢測結果顯示，與對照組相比，DM組HepG2細胞抑制率顯著升高(P<0.05)；相較于DM+pcDNA組，DM+pcDNA-HK2組HepG2細胞抑制率顯著降低(P<0.05)。 流式細胞儀檢測結果顯示，與對照組相比，DM組HepG2細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；相較于DM+pcDNA組，DM+pcDNA-HK2組HepG2細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖5，表4。

細胞克隆形成實驗后，通過單擊多靶模型擬合計算得出，在HepG2細胞中對照組和DM組D0值分別是2.612、1.424，Dq為1.959、0.706 Gy，N為2.117、1.642；DM+pcDNA組和DM+pcDNA-HK2組D0值分別是1.285、2.061，Dq為0.769、1.666 Gy，N為1.819，2.244，DM組SER為1.834，DM+pcDNA-HK2組為0.624。細胞的存活擬合曲線如圖6顯示，在同一劑量照射下，DM聯合照射組的存活率明顯小于單純照射對照組，細胞的存活曲線明顯下移；且隨著照射劑量的增加，曲線下移的趨勢呈現直線型。而在同一劑量照射下，DM+pcDNA-HK2聯合照射組的存活率明顯小于DM+pcDNA照射組，細胞的存活曲線明顯上移；且隨著照射劑量的增加，曲線上移的趨勢更加明顯(均P<0.05)。

圖5 HK2蛋白表達

表4 HK2過表達逆轉了DM對肝癌HepG2細胞增殖、凋亡的作用

圖6 不同劑量照射后HepG2細胞的存活曲線

3 討 論

肝癌是嚴重威脅人類生命健康的疾病〔11〕。中醫藥在肝癌的治療中具有重要作用，中藥主要通過抑制癌細胞增殖、誘導凋亡、直接殺傷癌細胞、抑制端粒酶活性、調節細胞信號轉導、調節機體免疫、抑制腫瘤血管生成、逆轉腫瘤耐藥性等方面達到治療肝癌的目的〔12〕。DM是從連翹中分離出的一種三萜類化合物〔13〕。研究發現 DM可調節細胞周期相關基因表達，誘導人前列腺癌PC-3細胞凋亡，抑制其細胞端粒酶活性，增加癌細胞的放療敏感性〔14〕。 DM可促進胃癌BGC-823細胞凋亡，提高細胞周期中G1期的比例，還有放療增敏作用〔15〕。謝麗等〔16〕研究也證明DM能阻滯細胞S期，誘導細胞凋亡，從而抑制細胞增殖。研究發現連翹可抑制小鼠肝癌的生長〔17〕。連翹醇提物對胃癌、肝癌、肺癌和大腸癌均有抗腫瘤效應，還能下調凋亡相關蛋白Survivin和Bcl-2 mRMA的表達〔18〕。

HK2是糖降解途徑第一步反應的限速酶，研究證明在多種腫瘤中高表達，給腫瘤的生長提供重要的物質基礎〔19〕。有研究表明HK2蛋白在肝癌組織中高表達，可作為預測肝癌術后腫瘤復發轉移的分子標志物〔20〕。HK2在肝癌細胞中上調表達，促進肝癌細胞的遷移和侵襲〔21〕。 HK2的活化與乙肝病毒感染的肝癌發生和發展相關〔22〕。沉默HK2可抑制乳腺癌細胞增殖，促進凋亡，增加乳腺癌對放射治療的敏感性〔23〕。HK2高表達增強放射治療抵抗性，導致宮頸鱗癌預后不良〔24〕。HK2在卵巢癌組織〔25〕、鼻咽癌〔26〕、結直腸癌〔27〕、胃癌〔28〕中上調表達，可預測癌細胞的轉移及預后。缺氧條件下，食管鱗癌中缺氧誘導因子(HIF)-1α及HK2表達升高，HIF-1α可能通過HK2影響細胞糖酵解水平〔29〕。shRNA干擾HK2基因的表達可抑制淋巴瘤細胞增殖，促進細胞凋亡，提高細胞對化療藥物阿霉素(DOX)的敏感性〔30〕。

一些中藥能夠影響HK的活性，進而影響腫瘤的增殖。研究發現健脾化瘀解毒中藥復方胃痞消能降低糖酵解酶HK2的活性〔31〕。而桑葉各有效部位可提高肝臟細胞HK的活性〔32〕。蟾蜍靈通過降低HK2的表達進而降低宮頸癌細胞的糖代謝水平，從而抑制細胞增殖〔33〕。氧化苦參堿明顯降低HK的活性，通過干擾HepG2細胞能量代謝來抑制細胞增殖、促進細胞凋亡〔34〕。小豆蔻明能增強HK活性，改善胰島素抵抗狀態下細胞的糖代謝，抑制高糖高胰島素刺激引起的血管平滑肌細胞的異常增殖〔35〕。雷公藤紅素能降低胃癌細胞SGC-7901和人臍靜脈內皮細胞ECV304中HK、乳酸脫氧酶(LDH)和琥珀酸脫氫酶(SDH)的活力，導致能量不足，抑制細胞增殖，從而達到抗腫瘤作用〔36〕。香加皮提取物杠柳苷能顯著抑制糖酵解HK-2基因的表達而抑制急性淋巴細胞白血病的生長〔37〕。本研究發現，DM及HK2抑制表達均能下調HK2的表達，抑制肝癌細胞的增殖，促進細胞凋亡。在同一劑量照射下，DM、si-HK2聯合照射組的存活率低，對增強了癌細胞的放療敏感性。HK2過表達逆轉了DM對肝癌HepG2細胞增殖抑制、凋亡促進及輻射增敏作用。