微生物角蛋白酶在納米粒子制備中的應用

葉金鵬，龔勁松，陳霞，蔣敏，李恒，李會，許正宏，3，史勁松

（1 江南大學藥學院，糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122；2 無錫市濱湖區榮巷街道社區衛生服務中心，江蘇無錫214151；3 江南大學生物工程學院，糧食發酵工藝與技術國家工程實驗，江蘇無錫214122）

金納米粒子（AuNPs）具有獨特的物理化學性質，包括光學效應、介電特性以及突出的生物相容性等特征，已被應用于醫學檢測、生物催化、新型藥物載體、環境保護、寡核苷酸芯片等領域[1-6]。納米金為分散相溶膠，粒子表面包覆著帶負電的離子，電荷之間的相互排斥作用使金納米粒子可以在水中維持著比較穩定的懸浮狀態，同時吸附水中的H+，從而形成穩定的膠體[7]。金納米粒子的制備已有較多文獻報道，目前常用的有物理法和化學法，其中物理法包括激光燒灼[8]、研磨粉碎[9]等，而化學法有種子生長法[10]、檸檬酸鈉還原法[11]等。盡管這些制備方法比較成熟，但仍然存在著過程復雜、條件苛刻、化學還原劑用量大等問題[12]。

近年來，已有許多研究者利用生物法制備出納米金粒子，陶晶利用蘆薈提取物制備出粒徑在20～50nm 的金納米粒子[13]，Rajasree 等[14]利用革蘭氏陰性菌熒光假單胞菌合成粒徑在50～70nm 之間的納米金粒子。某些微生物酶或植物蛋白可作為還原劑應用于金納米粒子的綠色合成，制備獲得的金納米粒子有更好的生物相容性，制備過程也較為溫和[15]。角蛋白酶是一種特殊的同時擁有肽鍵水解和二硫鍵還原特性的多功能蛋白酶類，能將硬質不溶性角蛋白（如羽毛、羊毛等）轉化為可溶蛋白、氨基酸及多肽[16-17]。微生物角蛋白酶來源廣泛，相比其他還原性功能的生物酶使用簡單，具有更廣泛的應用價值。本研究首次探索了微生物角蛋白酶制備金納米粒子的方法。

枯草芽孢桿菌WB600 是本研究室構建的高表達角蛋白酶基因的一株工程菌，其分泌的角蛋白酶具有較強的還原力[18]。本文利用該角蛋白酶制備金納米粒子，主要研究了加酶量、反應時間和氯金酸濃度對納米金顆粒的影響，通過電感耦合等離子體質譜儀（ICP-MS）對反應過程進行監測，然后通過透射電鏡（TEM）、動態光散射（DLS）、傅里葉紅外光譜（FTIR）等方法對金納米粒子進行了表征。

1 實驗材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株枯草芽孢桿菌WB600（PMA5-aprE-kerBv），為本實驗前期構建所得[18]。

1.1.2 主要試劑

氯金酸、瓊脂粉、甘油、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈉、脫脂奶粉購于國藥集團化學試劑有限公司；酵母粉、蛋白胨（生化試劑） 購于OXOID公司；可溶性角蛋白購于TCI公司。

1.1.3 培養基

LB 液體培養基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉10g/L。

TB 液體培養基：酵母粉28g/L，蛋白胨14g/L，甘油20g/L，磷酸氫二鉀16.4g/L，磷酸二氫鉀2.3g/L。

牛奶固體LB 培養基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，脫脂奶粉10g/L，氯化鈉10g/L，瓊脂粉15g/L。

1.2 角蛋白酶的制備

將枯草芽孢桿菌WB600 劃線接種在牛奶固體瓊脂培養基上，在37℃恒溫培養箱培養12h后，選擇平板上透明圈較大且生長較快的單菌落，轉接至LB 液體培養基中。在37℃、220r/min 的恒溫回旋式搖床中培養12h 作為種子液，以5%接種量接種至TB 液體培養基，在37℃、220r/min 的回旋式搖床中發酵產酶[18]。最后將發酵液在7500r/min、4℃條件下離心20min，獲得的上清液用孔徑為0.22μm的微孔濾膜過濾除菌，用文獻[18]中報道的方法測定角蛋白酶活性及其還原力，低溫儲存備用。

1.3 金納米粒子的制備及條件優化

稱取適量的氯金酸粉末，室溫下溶于超純水中，用0.22μm微孔濾膜過濾除菌。根據實驗設計，量取50mL 氯金酸溶液加入250mL 的錐形瓶中，加入一定量的角蛋白酶；用錫紙包裹錐形瓶，在搖床中以37℃、100r/min的條件振蕩反應一定時間并取樣進行紫外-可見分光光度（UV-vis）光譜掃描。制備過程通過控制合成反應中的三個因素進行逐步優化，分別為氯金酸濃度（0.5mmol/L、1mmol/L、1.5mmol/L、2mmol/L、2.5mmol/L、5mmol/L）、酶添加 量（700U、 875U、 1050U、 1225U、 1400U、1575U、1750U）以及合成反應時間（1h、3h、5h、7h等）。

1.4 金離子濃度的測定

將定時取樣的反應液在15000r/min的條件下離心30min，使金納米粒子完全沉淀于離心管底部。利用超純水將反應上清液稀釋一定倍數，利用電感耦合等離子體質譜儀（NexION 350D，PerkinElmer公司）測定上清液中殘余的金離子濃度，以計算反應的產率及速度。

1.5 金納米粒子的表征

UV-vis 光譜掃描：采用酶標儀（SpectraMax M2e，Molecular Devices 公 司） 對 樣 品 在480～600nm的波長內進行掃描，分別率為3nm，觀測金納米粒子的表面等離子共振吸收峰變化。

透射電鏡（TEM）觀測：納米顆粒樣品通過透射 電 子 顯 微 鏡（H-7650，HITACHI 公 司） 在120kV加速電壓下觀察微觀形態。

紅外吸收光譜（FTIR）：將待測樣品用毛細管沾在溴化鉀鹽片上，涂抹均勻，放在紅外燈下烘干，使用紅外光譜儀（TENSORⅡ型，BRUKER 公司）掃描，波長范圍500～4000cm-1，分辨率4cm-1，背景和樣品掃描次數均為16。

納米粒度及zeta電位分析：采用動態光散射納米粒度分析儀（NICOMP 380ZLS，PSS 公司）進行分析，采用Nicomp分布輸出結果。zeta電位檢測過程需要將樣品注入帶電極的樣品檢測池，同時檢測池中避免氣泡帶入。

2 實驗結果與討論

2.1 金納米粒子的制備

角蛋白酶kerBv 表現出較強的還原性能，對羽毛的高水解活性也源于對二硫鍵的還原作用，能將溶液中的金屬離子還原為金屬單質。為充分挖掘該酶的應用潛力，本實驗采用角蛋白酶為還原劑進行金納米粒子的制備，在實驗過程中，通過控制氯金酸濃度、酶液添加量和反應時間三個因素逐步進行合成反應優化。由于金納米粒子的表面存在等離子共振，在不同的波長下有不同的吸收值[19]，所以本研究采用UV-vis光譜掃描檢測金納米粒子的形成。

2.1.1 角蛋白酶量對金納米粒子的影響

分別對不同加酶量所制備的納米金樣品進行UV-vis光譜掃描，結果如圖1所示。在反應進行4h后，含有700U 角蛋白酶的體系無明顯共振峰峰值出現。隨著加酶量的增大，反應體系在550nm處出現明顯的共振峰，而且共振峰的大小先隨著加酶量的增加而增大，在加酶量為1400U時達到了最大值0.65。然而，在加酶量為1575U、1750U 時峰值下降，分別為0.60和0.52。推測是由于體系中加酶量太高，反應速率過快導致生成的金納米粒子迅速沉降。所以本研究選擇了1400U為最適加酶量，并用于下一步實驗。

圖1 加酶量對金納米粒子吸收峰的影響

2.1.2 氯金酸濃度對金納米粒子的影響

在酶法制備納米金的過程中，角蛋白酶起還原劑的作用，而氯金酸就是金單質的前體物質。圖2是納米金共振峰隨著氯金酸濃度變化圖。當濃度為1mmol/L 時，反應體系的峰強最強，峰值為0.81。當濃度為1.5mmol/L、2mmol/L、2.5mmol/L時，峰值分別為0.74、0.44和0.56，均小于1mmol/L時的峰值。由此可知，當氯金酸濃度為1mmol/L時，金納米顆粒的產率最高。后續研究選擇1mmol/L 氯金酸和1400U 角蛋白酶研究反應時間的影響。

圖2 氯酸金溶液濃度對金納米粒子吸收峰的影響

2.1.3 反應時間對金納米粒子的影響

反應時間是影響反應進行程度的一個因素。分別對不同反應時間所制備的金納米粒子樣品進行UV-vis 光譜掃描，結果如圖3(a)所示。反應2h 時，體系中沒有檢測到由金納米粒子產生的共振峰峰值。隨著反應時間的延長，共振峰峰值增大。當反應進行5h 后，反應體系的峰值達到最大值0.93。而在6h 時，峰值下降，說明體系中納米金顆粒變少，推測是由于反應時間過長，已經產生的納米粒子形成了團聚。最終，本研究以1mmol/L氯金酸溶液、1400U 角蛋白酶反應5h 為制備金納米粒子的最優條件。此外，各體系共振峰位置隨反應的進行并未發生移動，表明角蛋白酶能夠合成穩定性良好的金納米粒子。

圖3 反應時間對體系的影響

2.1.4 金納米粒子的產率分析

采用上述優化條件，即體系中氯金酸濃度為1mmol/L、角蛋白酶用量1400U、反應時間5h 進行金納米粒子制備。為了監控最優反應條件下反應進行的程度，本研究利用電感耦合等離子質譜儀（ICP-MS）測量經高速離心后的反應液上清液中金離子的殘留情況，結果如圖3(b)所示。從圖中可以看出，上清液中金離子的濃度隨著時間的延長而下降。在1h 濃度下降的速度最快，然后逐漸變慢。在反應前期，由于金離子濃度和角蛋白酶量較大，所以反應速度較快。在后期，由于底物濃度下降，所以反應速度變慢，同時曲線在5h 趨于平緩。在最優條件下進行金納米粒子制備，5h 時收率可達到85%，在1L 的反應體系中制備金納米粒子的平均速度為166.5mg/h。

2.2 金納米粒子的形貌表征

采用優化條件進行金納米粒子制備，通過透射電鏡對金納米粒子的形態進行觀察，結果如圖4所示。大部分粒子的形狀為球形，分散在溶液中，沒有發生聚集現象。對視野范圍內的粒子進行測定，可知粒徑均在30nm以下，粒子之間間距比較明顯，沒有聚集。但是金納米粒子粒徑仍不夠均勻，推測是由于在將角蛋白酶液滴入氯金酸溶液的一瞬間，局部的角蛋白酶濃度較高，導致金單質的生成速度過快，迅速凝聚成粒徑為30nm 的較大納米粒子。而在將體系混勻之后，反應速度下降，所以制備出的金納米粒子粒徑較小。

圖4 金納米粒子的TEM表征

2.3 金納米粒子紅外吸收光譜

用傅里葉變換紅外光譜（FTIR）對金納米粒子進行表征。從紅外光譜圖（圖5）中可看出，波長介于3100～3500cm-1之間的吸收帶是酰胺N—H鍵的不對稱伸縮振動峰，1452cm-1處的吸收帶歸因于氨基酸殘基—COO—基團的對稱伸縮振動，而1650cm-1處的吸收帶則代表的是酰胺Ⅰ帶[20]。可以初步推斷，角蛋白酶本身參與了金納米粒子的合成，并成為維系粒子穩定的關鍵物質。

圖5 金納米粒子的紅外光譜圖

有研究報道[21]一些蛋白質可以參與到納米金粒子的構成，同樣還有一些多糖類物質。那么角蛋白酶這種構成作用是否只是其蛋白質的一般屬性，與其催化活性是否相關呢？為此，本研究構建了一個活性中心突變、完全失活的重組角蛋白酶（D32F），將其一起用于還原力測試以及金納米粒子的合成實驗。結果如圖6(a)、(b)所示：失去催化活性的一組，還原力明顯降低，同時其制備出的納米金吸收峰明顯弱于實驗組的吸收峰，說明角蛋白酶的活性對金納米粒子的合成是必要的，其催化作用在金納米粒子的形成過程中起到關鍵作用。Lateef 等[22]首次報道了將角蛋白酶成功應用于銀納米粒子的制備中，并且制備得到的納米銀擁有較好的抗菌性能。Jang等[23]最近的研究也證實了角蛋白酶生物法合成納米銀的可行性。但是利用角蛋白酶制備金屬納米粒子的原理尚不明確。根據文獻報道，酶法制備金屬納米粒子與酶活性中心處的氨基酸殘基有關[24-26]。本研究使用的角蛋白酶屬于絲氨酸蛋白酶。本文作者推測角蛋白酶法制備金納米粒子的可能機理為：角蛋白酶活性中心的絲氨酸殘基和金離子發生氧化還原反應，金離子被還原為金納米粒子，同時納米粒子表面被角蛋白酶包裹以維持穩定狀態。有關其準確的反應機理有待未來進一步研究確認。

圖6 活性酶與變性酶的比較

2.4 金納米粒子的粒徑分布檢測

動態光散射的結果如圖7所示，實驗所得金納米粒子的粒徑大部分分布在75nm 左右，zeta 電位值為-13mV，表明其膠體的穩定性主要來源于負電荷之間的靜電排斥。由于透射電鏡（TEM）是在粒子干燥的狀態下拍攝的，所得的粒徑是粒子的真實粒徑。動態光散射（DLS）測量的是粒子在溶液狀態下的水合粒徑，包括粒子的核以及膨脹的膠團。所以DLS測得的粒徑會高于其真實值，這一現象在其他研究中也有報道[27-28]。

圖7 金納米粒子的粒徑分布

3 結論

本實驗采用角蛋白酶法所得金納米粒子的粒徑在30nm以下，PDI指數為0.29，zeta電位為-13mV，在550nm左右有明顯吸收峰。該實驗證明有活性的角蛋白酶有助于金納米粒子的生成，并且所得金納米粒子粒徑較小，制備時間較短。該方法具有的良好的穩定性和可操作性，為金納米粒子綠色化制備提供了一種新途徑。但是目前制備出的金納米粒子粒徑分布較寬，樣品尺度均一性仍有待進一步改進，后續可進行制備條件的進一步優化。