化療和維生素D3免疫對結核病T淋巴細胞亞群內穿孔素和顆粒溶素表達的影響＊

黃建華，農雪萍，陳艷玲，萬引，張愛妹

（江西省胸科醫院，南昌 330006）

結核病（tuberculosis，TB）是由結核分枝桿菌引起的慢性傳染病，結核病目前仍是嚴重危及全球的公共衛生問題之一[1]。2016年全球共報道1040萬例結核病新發病例，近170萬死亡病例與結核病相關[1]。人群中，有近三分之一的人口感染了結核分枝桿菌，大約10%的感染者在其一生中會患上活動性結核病。通過開發有效疫苗和免疫治療方法，了解宿主對結核分枝桿菌感染的反應機制，是人類抗擊結核病的關鍵。

機體對結核分枝桿菌的免疫反應從肺泡巨噬細胞和常駐樹突狀細胞吞噬菌體開始。自然殺傷（NK）細胞和細胞毒性T淋巴細胞通過FasL依賴機制或通過分泌細胞毒性分子殺死受感染的細胞[2，3]。NK 細胞、NKT 細胞、CD4+細胞和 CD8+細胞產生的穿孔素、顆粒溶素和顆粒酶等細胞溶解效應分子在控制Mtb感染中發揮重要作用[4-6]。穿孔素在細胞壁/細胞膜上鉆孔，促進顆粒溶素和顆粒酶的進入。顆粒酶B誘導感染細胞凋亡，而顆粒溶素通過增加膜通透性而殺死Mtb[7]。此外，顆粒溶素除了其細胞溶解活性外，還介導炎癥反應[8]。據報道，過度的T細胞活化和增殖會在疾病的活躍期引起嚴重的炎癥和組織損傷[9]。提示，宿主免疫反應在感染過程中應當得到適當控制。因此，宿主導向治療已成為抗結核病的有效的輔助治療方法。

維生素D3(Vitamin D3，V D3)被認為是一種有效的宿主導向治療藥物，其活性形式1，25（OH）2D3能夠下調細胞毒性細胞的過度激活，并在許多自身免疫條件下上調免疫抑制反應[10]。有研究表明，維生素D3作為抗結核藥物的輔助藥物，能夠縮短治療周期[11]。臨床研究顯示，補充維生素D3能夠改善結核病患者臨床癥狀，抑制抗原刺激的促炎細胞因子反應，并在治療期間加速炎癥反應的減弱[12]。然而，維生素D3對化療過程中結核病細胞毒性T淋巴細胞亞群內穿孔素和顆粒溶素表達的影響目前尚未見有相關報道。本項研究通過建立小鼠結核病模型，使用流式細胞術觀察，維生素D對化療后小鼠外周血中CD4+和CD8+T淋巴細胞中穿孔素和顆粒溶素的表達水平，為結核病的預防、診治及預后評估開辟新的方向。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 4-6周齡雄性ICR小鼠，均購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。在SPF級屏障系統中飼養，環境溫度20-26℃，相對濕度40%-70%。

1.2 主要試劑 CD4和CD8單克隆抗體以及相應同型對照抗體均購自Proteintech（美國），穿孔素和顆粒溶素單克隆抗體及相應同型對照抗體均購自eBioscience（美國），紅細胞裂解液購自北京索萊寶科技有限公司，細胞固定和破膜加透化固定試劑盒購自BD（美國），人型 MTB H37Rv由中國藥品生物制品檢定所捐贈。

1.3 實驗分組及處理 將100只ICR小鼠隨機分為 5 組：空白對照組（Ctrl）、結核病模型組（TB）、化療組（C）、結核病維生素D治療組（VD）和結核病化療聯合維生素D治療組（C+VD）。空白對照組：ICR小鼠經尾靜脈注射1ml無菌生理鹽水，并在第4周開始連續腹腔注射生理鹽水1ml/只/次 2個月；結核病模型組：ICR小鼠經尾靜脈注射1ml結核分枝桿菌混懸液（細菌數109個），并在第4周開始連續腹腔注射生理鹽水1ml/只/次2個月；化療組：結核病模型組ICR小鼠經尾靜脈注射1ml結核分枝桿菌混懸液（細菌數109個），常規飼養4周后，每只小鼠每天腹腔注射給予異煙肼（10mg/kg）、利福霉素SV鈉（10mg/kg）進行化療，連續給藥8周；維生素D治療組：ICR小鼠經尾靜脈注射1ml結核分枝桿菌混懸液（細菌數109個），常規飼養4周后，在第4、6、8、10周分四次皮內給予維生素D3 0.1mg/只/次；化療聯合維生素D治療組：ICR小鼠經尾靜脈注射1ml結核分枝桿菌混懸液 （細菌數109個），在接受化療的基礎上，同時給予維生素D3。各組小鼠在第4個月初心臟采血，一部分用肝素抗凝，一部分室溫靜置2h后3000轉離心5min取血清。

1.4 流式細胞檢測 ⑴細胞表面染色：將采集的小鼠全血平分2個離心管，命名為A管和B管，A管加入適量CD4和CD8單抗，B管加入適量CD4和CD8同型對照抗體，4℃孵育30 min。⑵溶血：每試管加入2 ml紅細胞裂解液，輕輕搖勻，室溫避光孕育18 min。⑶離心：沖洗2次(每試管加入1ml沖洗液沖洗)200g離心5 min。⑷固定和破膜細胞：重懸細胞后各管加入250μl Fixation/Permeabilization液 4℃孵育20 min。各管加入1mlPerm/WashTM緩沖液沖洗2次 (250 g離心5 min)。⑸標記細胞因子：Perm/WashTM緩沖液重懸細胞后每個樣本再分2 管，即 A1、A2、B1、B2。A1 加入適量穿孔素單克隆抗體、A2加入適量顆粒溶素單克隆抗體、B1加入適量穿孔素同型對照抗體、B2加入適量顆粒溶素同型對照抗體 ，避光 4℃孵育30min。各管加入1mlPerm/WashTM緩沖液沖洗2次，沖洗液重懸細胞。⑹上機檢測。

1.5 ELISA檢測 使用IL-10和IL-17A的ELISA檢測試劑盒，檢測血清樣本中IL-10和IL-17A含量水平，操作步驟嚴格按照廠家提供的說明書進行。

1.6 數據統計分析 所有實驗結果均運用均數±標準誤（Means±S.E.M）表示，通過系統統計軟件IBM SPSSStatistics 20.0進行單因素方差分析（One-way ANOVA），結果中 P＜0.05為顯著性差異。

2 結果

2.1 維生素D3輔助治療對穿孔素表達的影響 使用流式細胞術檢測各實驗組小鼠外周血淋巴細胞穿孔素的表達情況，結果見圖1：與健康小鼠相比，結核病模型小鼠淋巴細胞總穿孔素表達水平、CD4+T淋巴細胞穿孔素表達水平以及CD8+T淋巴細胞穿孔素表達水平均顯著降低（P＜0.05）；異煙肼（10mg/kg）和利福霉素SV鈉藥物治療后，核病模型小鼠淋巴細胞總穿孔素表達水平、CD4+T淋巴細胞穿孔素表達水平以及CD8+T淋巴細胞穿孔素表達水平均顯著增加（P＜0.05）；單獨使用維生素D3干預，核病模型小鼠穿孔素表達水平未見明顯變化（P＞0.05）；與化療組相比，化療聯合維生素D3治療的小鼠淋巴細胞總穿孔素表達水平、CD4+T淋巴細胞穿孔素表達水平以及CD8+T淋巴細胞穿孔素表達水平均顯著降低（P＜0.05）。

圖1 維生素D3輔助治療對穿孔素表達的影響

2.2 維生素D3輔助治療對顆粒溶素表達的影響使用流式細胞術檢測各實驗組小鼠外周血淋巴細胞顆粒溶素的表達情況，結果見圖2：與健康小鼠相比，結核病模型小鼠淋巴細胞總穿孔素表達水平、CD4+T淋巴細胞顆粒溶素表達水平以及CD8+T淋巴細胞顆粒溶素表達水平均顯著降低 （P＜0.05）；異煙肼（10mg/kg）和利福霉素SV鈉藥物治療后，核病模型小鼠淋巴細胞總顆粒溶素表達水平、CD4+T淋巴細胞顆粒溶素表達水平以及CD8+T淋巴細胞顆粒溶素表達水平均顯著增加（P＜0.05）；單獨使用維生素D3干預，核病模型小鼠顆粒溶素表達水平未見明顯變化（P＞0.05）；與化療組相比，化療聯合維生素D3治療的小鼠淋巴細胞總顆粒溶素表達水平、CD4+T淋巴細胞顆粒溶素表達水平以及CD8+T淋巴細胞顆粒溶素表達水平均顯著降低（P＜0.05）。

圖2 維生素D3輔助治療對顆粒溶素表達的影響

2.3 維生素D3輔助治療對IL-10和IL-17A水平的影響 使用ELISA法檢測小鼠血清中IL-10和IL-17A含量水平，結果見圖3：與健康小鼠相比，結核病模型小鼠血清中IL-10水平顯著降低（P＜0.05），IL-17A 水平顯著升高（P＜0.05）；單獨化療和單獨使用維生素D3干預后，核病模型小鼠血清中IL-10水平均顯著升高（P＜0.05），IL-17A 水平均顯著降低（P＜0.05）；與化療組相比，化療聯合維生素D3治療的小鼠血清中IL-10水平均顯著升高 （P＜0.05），IL-17A 水平均顯著降低（P＜0.05）。

圖3 維生素D3輔助治療對IL-10和IL-17A表達的影響

3 討論

T細胞免疫對于結核病發生發展至關重要，CD4+和CD8+T淋巴細胞在宿主保護中起著關鍵作用[13]。CD4+和CD8+T細胞能夠通過胞吐的形式分泌釋放細胞溶解分子 （如穿孔素）和抗菌分子（如顆粒溶素）到細胞毒性T淋巴細胞和受感染靶細胞之間的細胞間突觸中。穿孔素可在細胞膜上形成孔，并通過細胞膜修復機制促進顆粒溶素進入受感染的細胞中[14]。研究發現，敲除穿孔素后的小鼠對結核分枝桿菌的易感性明顯增加[15]。顆粒溶素在重組后能夠殺死多種微生物，包括細菌、真菌、酵母、寄生蟲等。它可以通過誘導細胞表面損傷并借助穿孔素破壞細胞內結核分枝桿菌來殺死細胞外結核分枝桿菌[16]。研究表明，肺結核發病部位穿孔素和顆粒溶素表達水平明顯低于正常組織和遠端肺組織，提示，穿孔素和顆粒溶素表達水平對于結核病的治療具有重要意義。在本項研究中，我們發現，感染了結核分支桿菌的小鼠T淋巴細胞亞群穿孔素和顆粒溶素表達水平均顯著降低，而化療能夠顯著提高小鼠T淋巴細胞亞群穿孔素和顆粒溶素水平，與前期研究結果一致[17]。

正常情況下，機體的炎癥反應和抗炎反應處于平衡狀態。過度的T細胞反應將造成嚴重的炎癥反應，損害機體組織。CD4+T細胞、CD8+T細胞等非常規T細胞表達多種促炎細胞因子，參與自身免疫性疾病的免疫病理過程。一些研究報告說，在許多炎癥條件下，IL-17+CD8+T細胞數量增加[18]。此外，CD8+穿孔素陽性細胞的積聚已被證明在慢性感染期間會導致組織損傷[19]。而顆粒溶素重組后的9kDa亞型被證明能夠激活促炎癥反應[20]。這些發現表明，過度的T細胞活化和增殖會在疾病的活躍期引起嚴重的炎癥和組織損傷。

宿主導向治療一種新型治療方法，通過調節宿主在感染過程中的免疫反應來控制疾病的嚴重程度。1，25（OH）2D3是維生素 D3在體內主要的活性代謝產物。 有報道顯示，1，25（OH）2D3能夠抑制分枝桿菌抗原刺激的淋巴細胞增殖，降低結核病中IF N-γ 和 TNF-α 陽性細胞數量[21]。 1，25（OH）2D3 還能通過減少對CTL產生至關重要的功能性細胞表面分子的表達，抑制細胞毒性T細胞分化[22]。在本項研究中，我們觀察了維生素D3輔助化療干預對結核病小鼠CD4+和CD8+T淋巴細胞穿孔素和顆粒溶素表達的影響，結果顯示，維生素D3輔助治療能夠明顯抑制化療引起的CD4+和CD8+T淋巴細胞穿孔素和顆粒溶素表達上調。進一步的，使用ELISA法檢測小鼠外周血中IL-10的含量，發現，維生素D3輔助化療能夠顯著提高小鼠外周血中IL-10的水平，并抑制IL-17A表達釋放。作為抗炎因子，IL-10能夠抑制抗原呈遞并在Foxp3+調節性T細胞（Tregs）的分化中起重要作用，后者可控制宿主T細胞在肺中的積累并限制隨后的效應子反應[23]。而IL-17A是參與炎癥反應的關鍵炎癥因子。以上結果提示，維生素D3可以通過在疾病活躍期調節細胞毒性分子的表達來幫助控制炎癥和組織損傷。

綜上，在本項研究中，我們觀察了維生素D3輔助化療對結核病小鼠外周血CD4+和CD8+T淋巴細胞表達穿孔素和顆粒溶素的影響，結果顯示，維生素D3輔助化療能夠明顯抑制小鼠外周血CD4+和CD8+T淋巴細胞表達穿孔素和顆粒溶素，同時提高小鼠外周血中抗炎因子IL-10的水平。因此，我們認為，補充維生素D3可以控制結核病治療過程中的炎癥反應并增強宿主對抗結核病治療的反應，從而縮短治療時間。進一步的應當開展臨床試驗，以為維生素D3輔助治療結核病提供更充分的科學依據。