人參皂苷Rg1對LPS誘導RAW264.7巨噬細胞炎癥反應中lncRNA NEAT1表達的影響＊

黃舒穎 ，張艷 ，陳鵬飛 ，張誠 ，黃自坤 ，羅清 ，卿城

（南昌大學第一附屬醫院，1.生殖科；3.藥學部；4.超聲科；5.檢驗科；6.重癥醫學科，南昌 330006；2.江西衛生職業學院護理系，南昌 330052）

膿毒癥是由感染原因造成的失控性全身炎癥反應，往往在短時間內就可形成危及生命的器官功能損害。雖然對于膿毒癥致病機理的研究在不斷深入，治療手段和理念也在不斷更新，但膿毒癥的死亡率仍然處于較高水平，是當前重癥醫學領域面臨的一項重大挑戰。

過度炎癥反應是膿毒癥早期重要的病理生理特點，巨噬細胞在此過程中發揮重要作用[1]。合理調節巨噬細胞免疫功能，對于膿毒癥治療具有重要意義。作為傳統名貴中藥材人參主要活性成分之一的人參皂苷Rg1（ginsenoside Rg1），經現代藥理學和臨床醫學研究表明，具有良好的抗炎、抗氧化等多種作用[2]。深入研究人參皂苷Rg1在膿毒癥疾病過程中對巨噬細胞炎癥免疫反應的調控機制，具有重要的科研和臨床價值。

長鏈非編碼 RNA （long non-coding RNA，lncRNA）是一類轉錄本長度大于200nt的非編碼RNA，在膿毒癥的發生、發展和預后評估中具有重要作用[3]。我們以往研究表明，膿毒癥病人PBMC細胞內lncRNA NEAT1（以下簡稱NEAT1）表達上升[4]；結核菌感染RAW264.7巨噬細胞可促進NEA T1表達上調，沉默NEAT1可減弱巨噬細胞對胞內結核菌清除能力[5]。即NEAT1是一個炎癥反應相關分子，推測其與膿毒癥免疫功能密切相關。基于以上認識，我們在體外通過內毒素（lipopolysaccharide，LPS）刺激RAW264.7巨噬細胞構建體外膿毒癥炎癥反應模型，觀察人參皂苷Rg1對巨噬細胞炎癥反應的調控作用，以及對NEAT1表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑 LPS（美國sigma公司）；人參皂甙Rg1（北京生物制品檢定所）；DMEM培養基（美國Hyclone公司）；胎牛血清 （中國杭州四季青公司）；TRIzol試劑和LipofectmineTM 2000轉染試劑（美國Invitrogen公司）；PCR引物 （中國上海生工生物工程公司）；IL-6 ELISA試劑盒 （上海明睿生物技術有限公司）；逆轉錄試劑盒與熒光定量PCR試劑盒（大連寶生物TaKaRa公司）。其它所用試劑均為分析純。

1.1.2 細胞系 RAW264.7巨噬細胞系，購買自中國科學院上海細胞研究所。

1.1.3 儀器 熒光定量 PCR儀器 （美國ABI公司Applied Biosystems 7600系統）；二氧化碳培養箱（美國 Thermo）；酶標分析儀（美國 Thermo）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 RAW264.7巨噬細胞種植在含10%胎牛牛血清的DMEM培養基，置于 37℃、5%CO2培養箱中培養，2-3d換液或傳代一次。

1.2.2 實驗分組與處理 選取對數生長時期的RAW264.7巨噬細胞加入24孔板，貼壁培養1h，隨機進行分組：⑴對照組：未經Rg1和LPS處理；⑵LPS組：加入終濃度10 mg/L的LPS培養6h；⑶Rg1+LPS組：終濃度為5、50μmol/L的Rg1預處理12h 后，分別加入 LPS（終濃度 0.1μmol/L），6h 后分別收集各組分細胞和培養上清用于后續實驗，每組實驗重復3次。

1.2.3 MTT檢測細胞存活率 細胞用胰酶消化，按1×104cells/well種植于96孔板，細胞融合到80%左右時吸去上清液，各孔加20μl MTT溶液，37℃培養箱中繼續培養4h，每個孔再加入150μl DMSO，避光震蕩10 min讓藍色結晶體充分溶解，于酶標儀490 nm波長處測定各組細胞OD值。

1.2.4 IL-6蛋白測定 細胞用胰酶消化，按照1×106cells/well種植于96孔板，各組分別加入相應成分，按上述1.2.2時間點結束培養，嚴格按照ELISA試劑盒實驗步驟檢測培養上清液IL-6濃度。

1.2.5 IL-6 mRNA和lncRNA NEAT1測定RT-qPCR檢測細胞內IL-6 mRNA和lncRNA NEAT1表達，Trizol法提取細胞總RNA，按TakaRa逆轉錄試劑盒說明書將細胞中RNA逆轉錄為cDNA；PCR引物購買于上海生工生物公司。以GAPDH為內參基因，各基因引物序列如下：GAPDH上游引物：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'， 下游引物：5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。NEAT1上游引物：5'-CTTCCTCCCTITAACTTATCCATTCAC-3'，下游引物 ：5'-CTCTTCCTCCACCATTACCAAC AATAC-3'[6]。 IL-6 上游引物：5′-AAACTAGTGAA ATATATCCTGTTGTCAGG-3′， 下游引物序列：5′-GGAAGCTTCCAACATTCATATTGTCAGTTC-3′[7]。qPCR反應采用SYBR Premix EX TaqTM II，使用ABI 7500系統進行上機，具體的檢測步驟及反應條件設置都按照試劑盒說明書進行。所有樣品做3副孔，RNA相對表達量以 2-△△Ct方法計算所得。

1.2.6 統計學處理 以SPSS19.0統計軟件進行分析，數據結果以()表示，兩樣本均數比較采用t檢驗，多組間的比較采用ANOVA方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人參皂苷Rg1對LPS誘導巨噬細胞存活率影響 MTT實驗顯示，與LPS組比較，50μmol/L的人參皂苷Rg1可提高巨噬細胞存活率，見表1。

表1 Rg1對LPS所致巨噬細胞存活率的影響

2.2 人參皂苷Rg1對LPS誘導細胞炎癥因子IL-6蛋白分泌和mRNA表達的影響 實驗結果顯示，LPS刺激巨噬細胞后，IL-6蛋白和mRNA較空白對照組表達顯著上調。加入Rg1后，與LPS組比較，5μmol/L低濃度組Rg1對LPS所致巨噬細胞IL-6蛋白和mRNA表達無明顯影響；50μmol/L Rg1組可顯著下調IL-6蛋白和mRNA表達 (P＜0.05)，見表2。

表2 Rg1對LPS誘導細胞IL-6蛋白和mRNA影響（n=3,）

表2 Rg1對LPS誘導細胞IL-6蛋白和mRNA影響（n=3,）

與 LPS 組比較：*P＜0.05；**P＜0.01

1.0±0.1 12.5±3.2 11.8±3.1 5.6±1.7*項目 IL-6（pg/ml） IL-6 mRNA 倍數空白對照組LPS組Rg1（5μmol/L）+LPS 組Rg1（50μmol/L）+LPS 組72.7±8.9 385.5±59.6 357.5±48.4 190.5±19.7**

2.3 人參皂苷 Rg1對LPS誘導巨噬細胞lncRNA NEAT1表達的影響 實驗結果顯示，LPS刺激巨噬細胞后，NEAT1較空白對照組表達顯著上調。加入Rg1后，與LPS組比較，5μmol/L低濃度組Rg1對LPS所致巨噬細胞NEAT1表達無明顯影響；50μmol/L Rg1組可顯著下調 NEAT1表達 (P＜0.05)，見表 3。

表3 Rg1對LPS所致巨噬細胞NEAT1表達影響()

表3 Rg1對LPS所致巨噬細胞NEAT1表達影響()

與 LPS 組比較：*P＜0.05

1.0±0.1 6.8±2.7 5.9±2.1 2.5±1.1*項目 NEAT1倍數空白對照組LPS組Rg1（5μmol/L）+LPS 組Rg1（50μmol/L）+LPS 組

3 討論

根據美國賓夕法尼亞州大學2018年在危重病醫學雜志發布的一篇研究報告顯示，從2010年到2015年，膿毒癥在內科和外科住院患者中所占的比例從3.9%上升到9.4%，30天的住院再入院率從2010年的26.4%小幅下降到2015年的23.1%[8]。國內北京協和醫院杜斌教授的流行病學研究結果顯示，我國外科ICU及綜合ICU的嚴重膿毒癥患病率分別為8.7%和37.3%，與來自歐洲的數據相近，由膿毒癥造成的死亡人數占12.6%[9]。面對膿毒癥如此高的發病率和死亡率，不得不引起醫學界在臨床科研上的高度重視。

巨噬細胞介導的炎癥免疫在膿毒癥病理生理過程中扮演關鍵角色，它作為一種固有免疫細胞，廣泛分布于體內各器官、系統，在受到致病微生物感染時，既能吞噬殺滅細菌，又能通過釋放炎癥介質、趨化因子招募更多炎癥細胞，放大炎癥反應；還能根據所處微環境變化，選擇性極化為促炎的“M1表型”或抑炎的“M2表型”，因而巨噬細胞是機體連接固有免疫反應和適應性免疫反應的重要橋梁[10，11]。在膿毒癥早期，巨噬細胞識別炎癥刺激分子，啟動炎癥反應，大量釋放炎癥因子。我們的研究表明，LPS刺激巨噬細胞6h后，促炎細胞因子IL-6在蛋白和mRNA水平明顯上調，促炎癥反應過程被啟動。

在炎癥反應過程中，既有炎癥因子的上調，也伴有促炎基因的表達上調。lncRNA是今年來炎癥免疫研究新的亮點和熱點。如lncRNA CD244可調控結核感染過程中CD8+T細胞IFN-γ和TNF-α分泌[12]；lncRNA GAS5可促進巨噬細胞呈M1極化[13]。NEAT1也是一個重要的促炎型炎癥調控分子，在THP-1免疫細胞中發現它可以調節炎癥因子IL-6、CXCL10表達[14]。我們課題組在研究結核菌感染巨噬細胞免疫反應過程中發現，H37Rv感染RAW264.7巨噬細胞后可促進NEAT1表達上調，下調NEAT1表達可減弱巨噬細胞對胞內H37Rv清除能力[6]。新晉吳緬教授課題組研究還發現[15]，N EAT1可以直接參與炎癥小體的組裝和激活，促進炎癥因子IL-1β分泌。另有多篇文獻報道RAW264.7細胞中，NEAT1下調可抑制炎癥因子IL-6在蛋白和mRNA水平的表達[16，17]。我們研究表明，促炎分子NEAT1在LPS刺激情況下表達上調，與炎癥反應過程同步。

抑制過度炎癥反應，一直是膿毒癥科研和臨床治療的重要方向之一。中醫藥治療膿毒癥，在2014年寫進了中國膿毒癥治療指南[18]。我們根據文獻報道[19]及以往的科研經歷，選擇了具有抗炎活性的傳統中藥單體活性成分人參皂苷Rg1。經試驗證實，人參皂苷Rg1一方面能改善LPS誘導的巨噬細胞存活率降低。另外一方面對LPS誘導的巨噬細胞炎癥反應具有抑制作用，表現為IL-6和NEAT1表達下調。表明人參皂苷Rg1的抗炎機制中，既可以抑制炎癥因子表達，也能調控促炎基因NEAT1表達，進一步豐富了人參皂苷Rg1抗炎機理。

綜上，本研究實驗證實內毒素可誘導巨噬細胞炎癥因子IL-6和促炎因子NEAT1表達上調；中藥單體成分人參皂苷Rg1具有抗炎作用，其機制可能與抑制IL-6和NEAT1表達有關，該研究為膿毒癥科研提供新的思路。