PD-1、TIM-3及HMGB1基因多態性在老年肺結核病人中的表達及與肺功能的相關性研究

徐萍 盧延虹 時志鵬

肺結核是結核分枝桿菌引起的慢性傳染病，可涉及諸多臟器而以肺部結核感染最為常見[1]。但是，人體感染結核菌后不一定發病，僅當機體抵抗力下降或細胞介導的變態反應增高時，才能引起臨床發病，影響病人的健康和生活[2]。細胞程序性死亡因子1(PD-1)、T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(TIM-3)是T細胞調節蛋白；而高遷移率族蛋白1(HMGB1)是一種高度保守的核蛋白，能直接參與機體多種病理、生理過程[3]。臨床研究表明，HMGB1能活化巨噬細胞釋放炎癥因子，引起機體炎癥反應，亦與機體免疫存在緊密的聯系[4]。PD-1、TIM-3及HMGB1基因多態性在老年肺結核中表達異常，能直接參與疾病的發生、發展，但是與病人肺功能的關系研究相對較少[5-6]。因此，本研究旨在探討PD-1、TIM-3及HMGB1基因多態性在老年肺結核病人中的表達及與肺功能的關系，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇我院2016年6月至2019年6月老年肺結核病人86例為觀察組，男47例，女39例，年齡61～94歲，平均(79.22±6.45)歲；病程1～7個月，平均(3.26±0.59)個月。納入標準：(1)均符合中華人民共和國行業標準肺結核診斷標準[7]；(2)均能完成外周血采集、肺功能測定；(3)意識尚清楚，能與醫生進行溝通、交流。選擇同期健康體檢者59例設為對照組，男32例，女27例，年齡60～90歲，平均(77.31±5.44)歲。排除標準：(1)合并肺外結核病、肺炎、塵肺及肺部實體瘤者。COPD等影響肺功能的疾病；(2)合并艾滋病、肝炎病毒感染或長期使用激素治療者。

1.2 儀器與設備 抗人TIM-3-FITC、抗人PD-1試劑盒(上海西塘生物科技有限公司)、PBS溶液(美國Hyclone公司)、DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)、DNA定量檢測試劑盒(美國Invitrogen公司)、AMpure磁珠(美國Beckman公司)。

1.3 方法 觀察組入院后空腹狀態下取外周血5 mL，對照組健康體檢當天取外周血5 mL，離心后放置在-80 ℃冰箱中，備用。

1.3.1 PD-1、TIM-3表達檢測：采用流式細胞儀測定2組外周血自然殺傷(NK)細胞表面PD-1、TIM-3表達水平。取上述分離的血清標本，在流式管中分別加入人流式抗體PD-1、TIM-3及單標和同型對照標記，向每個流式管中加入全血50μL，充分混合后完成15 min孵育。向混合溶液中加入溶血素1 mL避光下完成10 min孵育，5 min離心，速度1000 r/min，采用PBS完成2次清洗，并將其放置在濃度4%多聚甲醛溶液500μL中固定、檢測。

1.3.2 HMGB1基因多態性測定[8-9]：采用高通量測序法完成HMGB1基因的單核苷酸多態性(SNP)位點檢測，分析2組SNP基因型、等位基因頻率存在的差異。(1)SNPs的挑取：查閱生物信息數據庫，結合既往研究報道確定HMGB1基因rs1045411、rs2249825、rs1412125 3個SNPs；(2)基因序列的確定：參考Genebank獲得HMGB1基因多態性引物序列，見表1；(3)DNA擴增反應條件：設置PCR參數為30 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，99 ℃ 5 min，5 ℃下5 min，連續進行35個循環，72 ℃10 min延長，獲得最終產物并放入1.5%瓊脂凝膠電泳，β-actin為內對照；(4)測序：配置濃度為2%瓊脂糖凝膠，將PCR擴增產物與凝膠充分混合、電泳，給予溴乙錠染色并完成電泳，拍照[10]。

1.3.3 肺功能水平測定：采用肺功能測定儀檢測2組FVC、FEV1及FEV1/FVC[11]。

表1 HMGB1基因多態性引物設計

2 結果

2.1 2組PD-1、TIM-3水平比較 觀察組PD-1、TIM-3水平均明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 2組PD-1、TIM-3水平比較

2.2 2組HMGB1基因SNP比較 2組rs1045411基因型差異無統計學意義(P>0.05)；觀察組rs2249825、rs1412125基因型頻率均高于對照組(P<0.05)；觀察組rs2249825、rs1412125基因型中CC基因頻率高于對照組(P<0.05)，見表3。

表3 2組HMGB1基因多態性比較

2.3 2組肺功能水平比較 觀察組FEV1、FVC及FEV1/FVC水平均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 2組肺功能比較

2.4 PD-1、TIM-3及HMGB1基因多態性與肺功能的相關性 Pearson相關性分析表明，肺功能與HMGB1基因多態性中的rs1045411無相關性(P>0.05)，與PD-1、TIM-3及HMGB1基因多態性rs2249825、rs1412125呈負相關性(P<0.05)，見表5。

表5 PD-1、TIM-3及HMGB1基因多態性與肺功能相關性(r)

3 討論

肺結核是臨床上常見的傳染性疾病，且全球約有1/3人口感染過結核分枝桿菌，但是僅有1/10感染者會進一步發展為肺結核。由此看出：肺結核的發生存在個體差異性，可能與肺結核的易感基因有關[12]。國外學者研究表明,結核病易感基因類型較多，常見的包括：維生素D受體、IL與Toll樣受體基因等[13]。臨床研究表明，肺結核的發生、發展是一個多因素參與過程，常伴有炎癥因子的共同參與，而T細胞則能參與疾病的發展。PD-1、TIM-3是目前臨床上研究較多的負性協同刺激因子。PD-1最早于1992年首次被發現，該基因主要定位于2號染色體上，其表達多與肺結核、類風濕性關節炎及系統性紅斑狼瘡等有關；而TIM-3表達多與乙型肝炎、肝硬化及肝癌等有關，能直接參與機體炎癥反應。本研究中，觀察組PD-1、TIM-3水平高于對照組(P<0.05)，說明PD-1、TIM-3在肺結核病人中呈高表達狀態，其水平能輔助臨床診療。

HMGB1是一種高度保守的核蛋白，能直接參與機體多種病理、生理過程。有研究表明，HMGB1能激活機體內的巨噬細胞，釋放大量炎癥因子，從而能誘導機體產生炎癥反應，其表達水平亦與機體免疫有關[14]。相關研究顯示，HMGB1基因多態性與肺癌、代謝綜合征及高血壓的發生有關，但是臨床上對于HMGB1基因多態性與肺結核的關系研究較少。本研究中，觀察組病人rs2249825、rs1412125基因型頻率均高于對照組(P<0.05)；觀察組rs2249825、rs1412125基因型中CC基因頻率均高于對照組(P<0.05)；觀察組FEV1、FVC及FEV1/FVC水平均低于對照組(P<0.05)，說明老年肺結核病人與HMGB1基因多態性有關，而CC單體型則為病人易感基因。臨床研究表明，HMGB1基因CC單體型病人的HMGB1蛋白表達水平增加，從而誘導巨噬細胞、淋巴細胞等免疫細胞因子的大量釋放，能促進老年肺結核的發生，加劇肺功能異常[15]。為了進一步分析PD-1、TIM-3及HMGB1基因多態性與肺功能的關系，本研究對其進行相關性分析，結果表明：老年肺結核病人肺功能與PD-1、TIM-3及HMGB1基因多態性rs2249825、rs1412125呈負相關性(P<0.05)，說明老年肺結核病人肺功能受到的影響因素較多，加強病人PD-1、TIM-3、HMGB1基因多態性測定能反映病情嚴重程度，利于臨床診療。但是，本研究中亦存在諸多不足，一方面納入病例數較少；另一方面對病人數據進行分析時存在無創，均需要進一步研究與探討。

綜上所述，PD-1、TIM-3在老年肺結核病人中高表達，而HMGB1基因CC單體型是肺結核的易感型，與肺功能水平存在相關性，能為肺結核診療提供依據和參考。