HPLC 法同時測定參苓護肝膠囊中4 種成分的含量

段立廣 閆 凱

（1、河北醫科大學第一醫院 藥學部，河北 石家莊050000 2、河北省藥品醫療器械檢驗研究院化學藥品檢驗室，河北 石家莊050000）

參苓護肝膠囊是由河北醫科大學第一醫院制劑室研制生產的復方制劑，由黨參、白術、茯苓、柴胡、木香、厚樸、當歸、白芍、赤芍、法半夏、郁金、甘草12 味藥組成，具有健脾益氣疏肝、保肝護肝、保肝康復等功效[1-4]。該復方成分組成復雜，作為院內制劑內控標準僅對茯苓、白術、芍藥進行了定性鑒別，尚無主要成分的含量測定。為全面提高參苓護肝膠囊的質量控制水平，保證人民用藥的有效性和安全性，本研究采用高效液相色譜法（HPLC）建立了同時測定芍藥苷、厚樸酚、和厚樸酚、木香烴內酯等4 種成分含量的方法，簡便快速，為更有效的控制參苓護肝膠囊的質量提供了參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

藥品: 芍藥苷（批號110736-201438）、厚樸酚（批號110729-201513）、和厚樸酚（批110730-201614）、木香烴內酯(批號111524-201509) 對照品購自中國食品藥品檢定研究院，參苓護肝膠囊樣品來自河北醫科大學第一醫院。甲醇、乙腈為色譜純，磷酸、為優級純；水為超純水。儀器:高效液相色譜儀（Agilent 1260，配備PDA 檢測器，美國Agilent 公司）；純水儀（Millipore 公司）；超聲儀（KQ-500KDE，昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 色譜條件

色譜柱:Thermo Accliam（5?m，4.6mm×250mm）；以乙腈（A）-0.1%磷酸（B）為流動相，梯度洗脫: 0～11min，7%→12% A；11～20min，12%→34% A；流速為1.0ml/min；檢測波長:230nm；柱溫：30℃；進樣量: 10μL。

1.3 溶液的配制

供試品溶液的制備：取本品，研細，取約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，稱定重量，超聲處理40 分鐘（功率400W，頻率40kHz)，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。對照品溶液的制備：取芍藥苷、厚樸酚、和厚樸酚、木香烴內酯對照品適量，精密稱定，分別加甲醇適量超聲溶解并稀釋制成含芍藥苷0.785mg/ml、厚樸酚0.201mg/ml、和厚樸酚0.9232mg/ml、木香烴內酯0.278mg/ml 的對照品儲備液。分別精密量取芍藥苷、厚樸酚、和厚樸酚、木香烴內酯儲備液各2.0ml，2.0ml ，1.0ml ，20.0ml，置于同一50ml 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液。

1.4 方法學考察

專屬性:考察色譜條件下，待測物質分離情況，以及待測樣品和陰性樣品中其他物質對待測成分的影響。線性關系:分別精密稱取芍藥苷、厚樸酚、和厚樸酚、木香烴內酯對照品適量，配置成系列濃度的對照品溶液，分別吸取10μl，注入液相色譜儀，按擬定的色譜條件測定，記錄峰面積。以對照品進樣量（μg）為橫坐標，對照品的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，求得回歸方程。儀器精密度:精密吸取混合對照品溶液10μl，注入液相色譜儀，測定，連續進樣5 次，測定峰面積。重復性試驗：取同一批樣品（批號：16081089），研細，分別稱取0.25 g、0.5g、0.75g 各三份，精密稱定，按“2.4”項下方法平行制備9 份供試品溶液，進行測定，計算得芍藥苷、厚樸酚、和厚樸酚、木香烴內酯的平均含量及RSD。穩定性試驗:取同一供試品溶液（批號：16081089），于0 小時開始測定，以后分別在3,6,12,15,20,24 小時測定一次，記錄峰面積。加樣回收試驗:采用加樣回收測定法。取已知含量的樣品（批號：16081089 含量見重復性結果），研細，取9 份，每份約0.25g，精密稱定，每三份為一組，分別精密加入用溶液配制的低、中、高三個濃度的混合對照品溶液25ml，按供試品溶液制備項下方法制備供試品溶液，進行測定，計算，芍藥苷、厚樸酚、和厚樸酚、木香烴內酯加樣回收率(n=9)。

2 結果

2.1 方法學評價

專屬性:在上述色譜方法條件下，各待測成分分離良好，樣品中其他成分不干擾測定，色譜圖見圖1。線性關系:四種待測成分線性關系良好,結果見表1。儀器精密度:4 種成分峰面積RSD 分別為0.2%，0.1%，0.1%，0.2%，表明儀器精密度良好。重復性試驗:芍藥苷、厚樸酚、和厚樸酚、木香烴內酯的平均含量(n=9)分別為3.4475mg/g，0.6750mg/g，0.9019mg/g，0.3481mg/g，RSD 分 別 為2.5%、1.9%、2.8%、2.2%，表明該方法重現性良好。穩定性試驗:芍藥苷、厚樸酚、和厚樸酚、木香烴內酯RSD 分別為1.7%、1.1%、2.2%、0.1%，表明供試品溶液至少在24 小時內穩定。加樣回收試驗:芍藥苷、厚樸酚、和厚樸酚、木香烴內酯加樣回收率(n=9) 分別為102.4% (RSD =2.3%)，100.2% (RSD =2.2%)，101.8% (RSD =2.5%)，104.0% (RSD =2.5%)。結果見表2，表明本方法回收率良好。

圖1 混合對照品（A）、樣品（B）和陰性樣品（C）的液相色譜圖（和厚樸酚（1）、芍藥苷（2）、木香烴內酯（3）、厚樸酚（4））

表1 線性關系考察結果

表2 回收率試驗結果

2.2 樣品分析

取3 批樣品，每批次平行2 份，分別按“1.2”項下方法制備供試品溶液，按“1.3”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積，再用外標法分別計算芍藥苷、厚樸酚、和厚樸酚、木香烴內酯的含量。計算芍藥苷、厚樸酚、和厚樸酚、木香烴內酯的含量，結果見表3。

表3 樣品中5 種成分含量（n=3）

3 討論

本實驗選用甲醇、70%甲醇、50%甲醇3 種不同提取溶劑，超聲、回流等不同的提取方法考察含量，結果采用甲醇超聲提取更完全，且操作簡單、快捷。

樣品處方中藥味多，成分復雜，雜質多，性質相近的成分多，在流動相的選擇中，分別嘗試了乙腈-0.3%三乙胺（磷酸調pH值2.5），乙腈-0.2%磷酸，乙腈-0.02mol/L 的磷酸二氫鉀等不同的流動相體系，最終采用乙腈-0.1%磷酸為流動相，梯度洗脫，可以使4 種成分完全分離，且峰形對稱。

在測定波長的選擇中，厚樸酚與和厚樸酚在210nm 波長附近未端有最大吸收[5]，木香羥內酯在220nm 波長附近有最大吸收[6]，芍藥苷在230nm 波長附近有最大吸收[7]。在200～220nm 波長下，對樣品進行測定，結果待測成分與雜質峰分離較差，因此選用待測成分響應較強且無雜質峰干擾的230nm 作為測定波長，此波長下所有成分均有較高的靈敏度，且各待測成分與雜質峰分離良好，陰性無干擾。

本實驗建立的HPLC 方法可實現對參苓護肝膠囊中芍藥苷、厚樸酚、和厚樸酚、木香烴內酯含量的同時測定，方法簡便，快速環保，專屬性、重復性、準確性、穩定性等良好，可作為參苓護肝膠囊的質量控制方法。