松材線蟲cyp-33D3基因的RNA干擾及其功能研究

馮夢婷，盛東萍，葉建仁，陳鳳毛，張曉陽，邱秀文1,＊

(1. 九江學院江西長江經濟帶研究院，江西 九江 332005；2. 江蘇省有害生物入侵預防與控制重點實驗室，南京林業大學林學院，江蘇 南京 210037；3. 江西農業大學生物科學與工程學院，江西 南昌 330045)

松材線蟲病，即松樹枯萎病（pine wilt disease,PWD），是一種以松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）為病原的國際檢疫性林業病害[1-2]。松材線蟲病具有發病部位隱秘、發病速度快、傳播蔓延迅速、傳播途徑多、治理難度大等特點，因此該病害又被稱為松樹的“癌癥”[3]。我國于1982年在南京中山陵首次發現松材線蟲病[4]，隨后在我國逐漸蔓延，已經造成了重大的經濟損失并嚴重威脅著我國眾多名勝風景區和松林生態系統安全。細胞色素P450（cytochrome p450, P450)，又稱單加氧酶，是一類由數量眾多、功能復雜的血紅素結合蛋白組成的同工酶，廣泛存在于細菌、真菌、動物和植物等生物體中[5]。細胞色素P450在內源性化合物（脂肪酸、膽汁酸、類固醇、蛻皮激素和保幼激素等）和外源性化合物（農藥、植物毒素和環境致癌物等）代謝過程中十分重要[6-8]。大量研究表明細胞色素P450基因參與代謝過程和抗性機制主要通過上調來實現。Maja等[9]研究發現秀麗隱桿線蟲受到毒物質侵害時，cyp-33D3基因表達量上調明顯。松材線蟲全基因組序列于2011年測序完成，為研究松材線蟲致病相關基因的功能奠定了良好的基礎[10]。我們前期研究發現松材線蟲感染松樹后，cytochrome P450 33D3 (cyp-33D3) 基因表達量上調顯著，表明cyp-33D3基因在松材線蟲致病過程中發揮了重要作用[11]。目前關于cyp-33D3基因的研究主要集中在過量表達方面，而關于該基因的功能研究鮮見報道。

RNA干擾（RNA interference, RNAi）現象廣泛存在于真核生物細胞中，它通過小分子雙鏈RNA誘導同源mRNA降解從而阻斷體內特定基因表達[12]。隨著RNA干擾機制被闡明，RNA干擾被認為是一種可以與基因敲除相媲美的技術，在基因功能、信號傳導通路和基因治療等研究領域得到了廣泛的應用[13-16]。本研究采用RNA干擾技術研究cyp-33D3基因沉默后對松材線蟲取食、繁殖和致病性的影響，闡明cyp-33D3基因在松材線蟲致病過程中的功能，為進一步明確松材線蟲分子致病機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試松材線蟲BxJJ01分離自江西省九江市的黑松疫木，并保存于九江學院植物基因資源重點實驗室。將松材線蟲接種至長滿灰葡萄孢（Botrytis cinerea）的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar, PDA）平板培養基上，25℃恒溫培養5 d，采用貝爾曼漏斗法分離線蟲，用無菌水清洗3次，1 500 r·min-1離心5 min。將離心得到的線蟲懸浮液儲存于1.5 mL離心管中，備用。

1.2 松材線蟲總RNA提取及cDNA的合成

根據RNA抽提試劑盒（天根生化科技有限公司）的使用說明書提取松材線蟲總RNA。利用紫外分光光度計（Nanodrop 2000）測定RNA濃度，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質量。根據TaKaRa公司反轉錄試劑盒（Prime Script 1ststrand cDNA Synthesis Kit）使用說明書將松材線蟲總RNA反轉錄為cDNA用于后續PCR實驗。

1.3 松材線蟲cyp-33D3基因片段的克隆

依據GenBank上下載的cyp-33D3(GenBank:KM973212.2)基因序列設計上游引物cyp-33D3-F（5′-TCACCGACTACGAGGTCC-3′）和下游引物cyp-33D3-R（5′-ATGGGATGAACGACGAAC-3′），以合成的cDNA為模板進行PCR擴增。反應條件為：94℃預變性5 s，94℃變性30 s，60℃34 s，72℃1 min，35個循環，72℃延伸10 min。根據Axygen公司的切膠回收試劑盒使用說明書對目標片段進行切膠回收，并克隆于PmdTM18-T載體上，轉化至大腸桿菌感受態細胞，委托華大基因公司進行測序。

1.4 松材線蟲cyp-33D3基因dsRNA的合成

以PmdTM18-T和pCH-sGFP載體為模板，通過帶有T7啟動子的引物進行PCR擴增，采用MEGAscript RNAi Kit Protocol 試劑盒（Life Technologies 公司）分別合成松材線蟲cyp-33D3和gfp基因dsRNA。用無RNA酶H2O適當稀釋合成的dsRNA，通過紫外分光光度計測定A260值，同時測定溶解dsRNA相應H2O的A260值作為空白值，dsRNA濃度（μg·mL–1）為260 nm的吸光值減去空白值后乘以稀釋倍數再乘以系數40。經測定合成的cyp-33D3和gfp基因dsRNA濃度分別為1.45 mg·mL–1和1.53 mg·mL–1，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測dsRNA完整性，將合成好的dsRNA儲存于–80℃冰箱，備用。

dsRNA濃度（μg·mL–1）=（A260-空白值） ×稀釋倍數 × 40

1.5 松材線蟲cyp-33D3基因的RNA干擾

將收集的松材線蟲混合蟲態浸泡于1 μg·μL–1的cyp-33D3 dsRNA中[17]，以gfp dsRNA 作為非靶標性dsRNA對照，以ddH2O作為空白對照，每個處理約8 000條線蟲，每次試驗3次重復，將各處理置于25℃搖床170 r·min-148 h后[15-16]，用ddH2O洗脫線蟲。

分別挑取30對（成熟雄蟲和雌蟲各30條）干擾后和對照組的松材線蟲，接種至長有灰葡萄孢的PDA平板上，25℃條件下培養5 d，用貝爾曼漏斗法進行分離。拍照觀察各處理松材線蟲取食情況，用光學顯微鏡統計其數量，每個處理3次重復。

分別挑取20對（成熟雄蟲20條，懷孕雌蟲20條）干擾后和對照組的松材線蟲，置于直徑為30 mm的小培養皿上，加入適量ddH2O，25℃黑暗培養12 h后，輕輕倒掉線蟲懸浮液，用無菌水將粘附在培養皿底部的線蟲蟲卵洗出，收集松材線蟲卵粒并統計其數量，每個處理重復3次。

分別挑取100顆線蟲蟲卵浸泡在等量的ddH2O、gfp dsRNA和cyp-33D3 dsRNA溶液中，置于25℃恒溫培養箱黑暗條件下孵化48 h。使用倒置顯微鏡對已孵化卵的數量進行計數，每個處理重復3次。

分別挑取20對（成熟雄蟲和雌蟲各20條）干擾后和對照組的松材線蟲，接種至長有灰葡萄孢的PDA平板上進行交配和繁殖，從而得到子一代（F1）的老熟成蟲。將獲得的成蟲轉移至孔板并用高溫殺死，在光學顯微鏡下測量其個體長度，每個處理重復3次。

采用人工皮接法分別將ddH2O浸泡和cyp-33D3dsRNA干擾后含有2 000條松材線蟲的懸液接種到生長情況一致的兩年生黑松上，同時將等體積的gfpdsRNA溶液接種至黑松，每個處理接種6株。接種后觀察松樹的發病情況，持續觀察40 d，統計發病率。

1.6 松材線蟲cyp-33D3基因干擾效率的測定

分別提取對照組和干擾后子一代（F1）松材線蟲總RNA，反轉錄合成第1鏈cDNA，以松材線蟲Actin基因為內參基因，根據TransStart Green qPCR SuperMix（北京全式金生物技術有限公司）試劑盒說明書進行熒光定量PCR，測定松材線蟲cyp-33D3基因的表達量。

2 結果與分析

2.1 松材線蟲cyp-33D3基因的克隆

以松材線蟲cDNA為模板，用特異性引物擴增獲得細胞色素cyp-33D3基因，結果顯示擴增片段長度介于1 000～1 500 bp之間（圖1A），與預期大小1 192 bp相符。回收目的條帶與pMDTM19-T載體連接后轉化至大腸桿菌Trans1-T1感受態細胞中，挑取陽性克隆進行測序驗證。通過帶有T7啟動子的特異性引物進行PCR擴增，合成dsRNA。從圖1B中可以看出，瓊脂糖凝膠電泳條帶單一、明亮、完整，可用于后續的RNA干擾實驗。

圖 1 松材線蟲細胞色素cyp-33D3基因的克隆（A）及雙鏈RNA的合成（B）Fig. 1 Clone of cyp-33D3 gene from B. xylophilus (A) and synthesis of double-stranded RNA (B)

2.2 干擾后松材線蟲cyp-33D3基因表達量分析

如圖2所示，松材線蟲經gfpdsRNA和cyp-33D3dsRNA浸泡后，cyp-33D3基因的表達量分別為0.974和0.036（將ddH2O處理對照組的細胞色素cyp-33D3基因表達量設為1），說明外源dsRNA對松材線蟲細胞色素cyp-33D3基因表達量無影響，而cyp-33D3dsRNA可以有效抑制靶基因的表達。

2.3 松材線蟲cyp-33D3基因RNAi對線蟲取食的影響

從圖3可以看出，ddH2O和gfpdsRNA處理的線蟲取食速度明顯較快，在第5天已經幾乎將灰葡萄孢菌絲取食殆盡，而cyp-33D3dsRNA處理松材線蟲取食灰葡萄孢的面積較小，說明細胞色素cyp-33D3基因表達沉默后對松材線蟲的取食有重要影響。

圖 2 RNAi后松材線蟲cyp-33D3基因表達分析Fig. 2 The analysis of expression of cyp-33D3 gene following RNAi of B. xylophilus

圖 3 RNAi對松材線蟲取食的影響Fig. 3 Effects of RNAi on feeding of B. xylophilus

2.4 松材線蟲cyp-33D3基因RNAi對線蟲個體體長的影響

經測量，ddH2O處理雌、雄成蟲的體長分別為964.33 μm和777.12 μm；gfpdsRNA處理雌、雄成蟲的體長分別為951.66 μm和775.34 μm；cyp--33D3dsRNA處理雌、雄成蟲的體長分別為942.57 μm和761.33 μm（圖4）。RNA干擾后雌、雄成蟲的體長有所減短，但差異不顯著（P＞ 0.05）。因此，我們推測RNA干擾對松材線蟲體長無明顯影響。

2.5 松材線蟲cyp-33D3基因RNAi對線蟲產卵的影響

由圖5可知，ddH2O和gfpdsRNA處理的每條雌蟲平均產卵數量分別為24和23粒，而cyp-33D3dsRNA處理中每條雌蟲平均產卵數量為12粒。結果表明，cyp-33D3dsRNA干擾顯著（P＜0.01）減少了雌蟲的產卵數量，降低了松材線蟲的繁殖能力。

圖 4 RNAi對松材線蟲成蟲個體體長的影響Fig. 4 Effects of RNAi on individual body length of adult B. xylophilus

圖 5 RNAi對松材線蟲產卵的影響Fig. 5 Effects of RNAi on oviposition of B. xylophilus

2.6 松材線蟲cyp-33D3基因RNAi對線蟲孵化率的影響

不同處理的松材線蟲卵孵化率如圖6所示，cyp-33D3dsRNA處理的蟲卵孵化率為49.67%，與ddH2O處理相比差異顯著（P＜ 0.01）；而gfpdsRNA處理和ddH2O處理的蟲卵孵化率無明顯差異（P＞0.05）。由此可見，cyp-33D3dsRNA干擾對松材線蟲卵孵化具有一定的抑制作用，而非內源雙鏈RNA干擾對其無影響。

2.7 松材線蟲cyp-33D3基因RNAi對線蟲致病力的影響

在接種40 d后，ddH2O處理的黑松針葉全部枯萎，發病率達到100%；cyp-33D3dsRNA處理的黑松發病率為43.1%；而gfpdsRNA處理的黑松在整個實驗過程中生長狀況良好，發病率為零（圖7）。據此推測，RNA干擾在一定程度上減弱了松材線蟲的致病能力，進而降低了黑松的發病率。

圖 6 RNAi對松材線蟲孵化率的影響Fig. 6 Effects of RNAi on percentage hatch of B. xylophilus

圖 7 不同接種處理后第40天黑松的發病狀況Fig. 7 Wilting symptoms of P. thunbergii after different inoculation treatments at 40 days

3 討論

由于松材線蟲的生活史和寄生環境與其他線蟲差別很大，致使其分子致病機制研究進展緩慢。Kikuchi等人于2011年完成了松材線蟲全基因組測序，這為進一步研究松材線蟲致病基因的功能奠定了良好的基礎。松材線蟲感染寄主后，寄主會分泌一系列的次級代謝產物抵御松材線蟲的入侵。有研究表明，CYP450基因產物是松材線蟲代謝寄主松樹次級代謝產物第一階段最重要的酶。我們的前期研究結果發現在松材線蟲入侵寄主后cyp-33D3基因表達量上調顯著，說明該基因在松材線蟲致病過程中發揮了重要作用。

RNA干擾是由與靶基因序列同源的雙鏈RNA引發的廣泛存在于生物體內的序列特異性基因轉錄后沉默的過程。RNA干擾具有特異、有效的基因沉默效應，克服了建立基因敲除動物模型費時費力的缺點，已成為研究基因功能非常有效的手段。Wang等[18]通過RNA干擾技術研究松材線蟲精氨酸激酶（BxAK1）基因的功能，發現該基因表達量下調增加了線蟲的死亡率，同時減弱了線蟲的繁殖能力。Kang等[19]通過該方法對松材線蟲毒液過敏原樣蛋白（BxVap-1）基因進行RNA干擾，結果表明毒液過敏原樣蛋白基因與線蟲的遷移能力有密切聯系。魏麗莎子等[20]利用RNA干擾技術對象耳豆根結線蟲二齡幼蟲Me-mapk1基因進行沉默，線蟲誘導番茄根結形成的數量顯著減少，推測Memapk1基因的下調表達有可能與象耳豆根結線蟲二齡幼蟲（J2）的生長發育相關。以上研究表明，RNA干擾是一種研究基因功能的有效技術。細胞色素P450作為線蟲體內三大與代謝抗性相關的超基因家族之一，對松材線蟲生長發育和致病性起到至關重要的作用。Benenati 等[21]通過RNA干擾技術研究了秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）cyp-31A2和cyp-31A3基因的功能，發現這兩個基因表達量下調導致線蟲胚胎細胞不能正確執行減數分裂以及卵殼形成所需的脂質物質合成受阻。Verma等[22]研究表明，cyp5122A1基因表達量下降增加了杜氏利什曼蟲（Leishmania donovani）的死亡率，降低了利什曼蟲對藥物的敏感性和減少了麥角固醇的合成。本研究通過RNA干擾技術沉默了松材線蟲cyp-33D3基因，發現cyp-33D3基因下調表達后，松材線蟲取食速率降低，繁殖能力下降。這可能是由于cyp-33D3基因沉默后影響了松材線蟲胚胎細胞減數分裂的正確執行，抑制了卵殼形成所需脂質物質的合成以及增加了線蟲的死亡率，導致線蟲繁殖數量下降，進而影響了松材線蟲的取食速度。

植物寄生線蟲致病的前提是能夠在寄主體內存活和進行繁殖。我們將cyp-33D3 dsRNA干擾后的松材線蟲接種至黑松苗上，發現線蟲的致病能力明顯下降，推測原因可能是：（1）cyp-33D3基因表達沉默后，松材線蟲在松樹體內的取食和產卵受到影響，進而降低了線蟲的繁殖數量，導致其致病力下降；（2）松材線蟲入侵寄主后，松樹會分泌出大量的次生代謝產物抵御松材線蟲的入侵，松材線蟲為了應對這些次生代謝產物的毒害作用，必須通過解毒基因對該類物質進行代謝轉化，由于CYP450基因在松材線蟲解毒過程中具有重要作用，因此cyp-33D3基因被表達被沉默后，可能致使松材線蟲不能有效降解寄主分泌的有毒次生代謝產物，大量線蟲被殺死，最終導致松材線蟲的致病力下降。我們的研究結果表明cyp-33D3基因與松材線蟲的取食、繁殖和致病力密切相關，為揭示松材線蟲cyp-33D3基因的功能提供了理論依據，對科學指導松材線蟲病生物防治具有重要的理論和實踐意義。然而，關于cyp-33D3基因對松材線蟲卵殼形成和致病力的具體調控機理還不清楚，還有待于進一步深入研究。

4 結論

通過RNA干擾技術對松材線蟲cyp-33D3基因功能進行了研究，發現cyp-33D3dsRNA 干擾可以有效抑制cyp-33D3基因的表達，cyp-33D3基因干擾后降低了松材線蟲的取食速度，每條線蟲的產卵數量以及蟲卵的孵化率都下降顯著（P ＜ 0.01）。然而，cyp-33D3基因干擾對松材線蟲個體體長影響較小。cyp-33D3基因干擾減弱了松材線蟲的致病能力，降低了黑松的發病率。本研究不僅為闡明松材線蟲cyp-33D3基因的功能提供了數據支撐，而且為研究松材線蟲其他基因的功能提供了參考。