土壤微生物群落結構研究方法＊

黃瀟，趙智勇，蔡穎慧

土壤微生物群落結構研究方法＊

黃瀟1，趙智勇1，蔡穎慧2

（1.山西省分析科學研究院，山西 太原 030006；2.山西省生物研究院有限公司，山西 太原 030006）

對土壤微生物群落結構研究方法進行了綜述，主要有生物化學研究方法和分析生物學研究方法兩大類。生化法研究土壤微生物群落結構的方法主要包括微生物平板記數法、底物利用分析法、生物標記法。土壤微生物在基因水平上的群落結構研究可以用核酸雜交技術、DNA成分多態性圖譜分析、DNA長度多態性圖譜分析、土壤宏基因組學、高通量測序技術等進行研究。目前，分子生物學、基因技術已在微生物群落結構研究中獲得了很大關注，高通量測序技術和基因組學技術也得到了更廣泛的應用。綜上所述，每個方法都有各自的有優缺點，在實際選取時需要結合實際情況。

土壤；微生物群落結構；研究方法；分子生物學

1 前言

土壤微生物維持著土壤物質循環和生態平衡，在植物養分轉換中起著重要的作用，是土壤生態系統的重要組分。土壤微生物的群落結構對土壤生態系統有很大影響，在調節土壤生態系統、環境治理和資源可持續利用方面具有重要意義。研究土壤微生物多樣性的方法有生物化學成分分析法和現代分子水平分析法兩大類。對土壤微生物群落結構的研究涉及多學科領域，如土壤學、微生物學及生態學等。該項研究對應對全球氣候變化、各類環境污染治理及維持生態功能等方面有重要意義。

2 土壤微生物群落結構的生化研究方法

生物化學法以生化角度為依據，主要包括平板記數法、底物利用分析法、生物標記法3種。

2.1 平板技術——培養鑒定法

此法用平板對細胞進行分離培養，后依據微生物菌落的數量和菌落的形態特征來判定微生物的數量及類型。該方法速度快，但無法重復土壤真實的生物指標，培養獲得的微生物數量遠遠小于實際微生物數量，甚至不足1%，該方法有一定的限制性和片面性，已逐漸被其他方法所替代[1]。

2.2 底物利用分析法

底物利用分析，主要有Biolog法，利用不同土壤微生物所需的碳源形式不同，比較鑒定微生物群落結構。譚兆贊等人用Biolog法分析了土壤微生物中的特征碳源，結果表明特征碳源對土壤微生物群落結構的變化更敏感。Biolog碳素利用法再現土壤微生物群落的原代謝特征，且靈敏度高、簡單快速、自動化程度高，但僅限于檢測可培養、能迅速生長的微生物[2]。

2.3 生物標記法

生物標記法中常用的主要有磷脂脂肪酸（PLFA）分析法，磷脂脂肪酸在活細胞中的含量相對恒定，但在死亡的細胞中會迅速分解。PLFA分析技術由WHITE首次提出，常用于計算總生物量。2004年，TOMOYOSHI等人發現了大米土壤中細菌群落多樣性和PLFA量呈比例關系。PLFA分析技術已被應用于對森林土壤、植物根際土壤、火災跡地土壤、植物入侵地土壤等微生物多樣性的研究方面[3]。PLFA分析法具有以下優點：能直接有效地提供微生物群落中的信息；對細胞生理活性沒有特殊的要求；不受質粒損失或增加的影響，實驗結果更為可靠。該方法經過不斷發展完善，目前多采用GC-MS方法，較為準確、快捷。

3 土壤微生物群落結構的分子生物學研究方法

隨著微生物研究技術的發展，尤其是分子生物學技術被廣泛運用，為生物多樣性研究提供了新的分析方法，豐富了土壤微生物結構研究方法。

3.1 核酸雜交技術

根據已知的核酸探針與待測樣品中的核酸序列形成特異性互補的原理，通過對雜交信號的熒光標記取代同位素標記的檢測分析，得到土壤微生物群落結構特征[4]。熒光原位雜交（FISH）技術已應用于土壤微生物群落結構檢測方面，它具有簡便快速、靈敏度高、探針保存期長等優點。

3.2 DNA成分多態性圖譜分析

DNA成分多態性圖譜分析，主要有DGGE和TGGE，即變性劑濃度梯度凝膠電泳和溫度梯度凝膠電泳。DGGE應用最為廣泛，主要原理是：長度相同而序列不同的DNA片段有不同的解鏈行為，凝膠分離后停留在不同的位置，能將同樣大小的DNA片段很理想地分開。TGGE則是利用溫度梯度變性的原理，對不同核苷酸片段進行分離與分析。 DGGE一般包括三個步驟：核酸提取，16SrRNA序列PCR擴增和指紋圖譜分析。DGGE和TGGE是很有用的分子標記方法，具有方便、結果分辨率高等特點，在分子微生物生態學研究中得到廣泛使用。張平究等人用DGGE方法研究了長期不同施肥條件下水稻土中微生物群落結構的變化[5]。

3.3 DNA長度多態性圖譜分析

DNA長度多態性圖譜分析最常用的是RFLP和T-RFLP法，即限制性片段長度多態性技術和末端限制性片段長度多態技術。RFLP法，是一種依據DNA多態性研究微生物多樣性的方法。方法程序為：用限制性內切酶酶切提取的DNA，后用凝膠電泳分開DNA片段，再把DNA片段轉移到濾膜上利用放射性標記的探針雜交顯示特定的DNA片段（Southern雜交）。王英等人用RFLP技術對免耕水稻土壤中細菌的多樣性和空間分布研究發現，細菌種類非常豐富，而且在不同層的土壤中存在空間差異性。T-RFLP技術與RFLP的原理相同，區別在于標記引物不同。T-RFLP是一種高效可重復的技術，它可以對一個生物群體的特定基因進行定性和定量測定，彌補了RFLP技術的局限性，簡化了圖譜，并且更準確地反映土壤微生物群落結構。DING等人采用T-RFLP技術研究了植物內生細菌的多樣性和動態變化。BARRETO等人用T-RFLP技術研究熱帶湖泊沉積物中，細菌、古細菌和產甲烷古菌的空間分布規律。該法優點是不需要純培養菌株，方法效率高、特異性強；缺點和局限性主要是假末端限制性片段的形成，可能導致對微生物多樣性的過多估計，引物和限制酶的選擇也是很重要的。

3.4 土壤宏基因組學

宏基因組學（Metagenomics）主要含義是：以特定環境中全部微生物的總DNA作為研究對象，著眼于功能基因的挑選，研究微生物群落結構演化關系及與環境之間的相互關系，不依賴于微生物的分離與培養，因而減少了由此帶來的瓶頸問題。該方法是1998年由HANDELSMAN等人首次提出的，對土壤微生物的豐度和種類進行了系統化研究，并構建16SrRNA基因文庫。優點是能更好地研究那些不能被分離培養的微生物，并通過整個群落環境及個體間相互影響，發現微生物群落共存特性。2014年，SMEDILE等人利用宏基因組學研究了地中海深海高鹽缺氧盆地的微生物系。2016年，南京農大基于Illumina的16SrRNA測序方法研究表明人參果的種植增加了喀斯特地區細菌群落的多樣性和豐度。

3.5 高通量測序技術

高通量測序技術，是近幾年發展起來的測序技術，主要分為三代。Sanger測序法，即雙脫氧核苷酸終止法是第1代高通量測序技術。方法流程為：樣本準備、文庫構建、測序反應及數據分析。第2代測序技術，主要指3個高通量測序平臺，主要包括Illumina 公司的Solexa合成測序平臺、Roche公司的454焦磷酸測序平臺和ABI的SOLiD連接法測序平臺。此技術可以檢測到低豐度微生物群落，且分析準確性得到很大提高。以單分子實時測序和納米孔為標志的第三代測序技術，依據熒光標記的脫氧核苷酸、納米微孔和共聚焦顯微鏡這3個關鍵技術，短時間可以讀取幾千個堿基，且準確度高于99.99%，主要有太平洋生物科學（Pacific Biosciences）公司推出的單分子實時DNA測序技術（Single Molecule Real Time，SMRT）、牛津納米孔技術公司（Oxford Nanopore Technologies Ltd）的納米孔單分子測序技術和生物科學（BioScience）公司的HeliScope單分子測序儀[6]。高通量測序技術現已作為研究土壤微生物群落結構的方法被廣泛關注。

4 小結與展望

從生物化學成分分析到現代分子生物學，每一種分析方法都能從一個角度揭示土壤微生物群落結構的特征，優缺點共存，同時也存在著一定的局限性。隨著生物信息學技術的發展成熟和實驗成本下降，高通量測序、宏基因組學會被更加廣泛關注和應用。綜上所述，每個方法都有各自的優缺點，在實際應用中需要結合實際情況做出選擇，在研究中盡可能獲得更為全面準確的信息，甚至建立全方法信息庫，或許是今后土壤微生物群落結構研究的趨勢。

［1］劉國華，葉正芳，吳為中.土壤微生物群落多樣性解析法：從培養到非培［J］.生態學報，2014，32（14）：4421-4433.

［2］朱菲瑩，肖姬玲，張屹，等.土壤微生物群落結構研究方法綜述［J］.湖南農業科學，2017（10）：112-115.

［3］劉搖微，王樹濤，陳英旭.轉Bt基因水稻根際土壤微生物多樣性的磷脂脂肪酸（PLFAs）表征［J］.應用生態學報，2011，22（3）：727-733.

［4］鐘文輝，王薇，林先貴，等.核酸分析方法在土壤微生物多樣性研究中的應用［J］.土壤學報，2009，46（2）：334-341.

［5］蔡晨秋，唐麗，龍春林，等.土壤微生物多樣性及其研究方法綜述［J］.安徽農業科學，2011，39（28）：17274-17278.

［6］李潔，李睿玉，楊紅，等.土壤微生物多樣性的研究方法［J］.山西農業科學，2016，44（11）：1738-1742，1746.

S154.3

A

10.15913/j.cnki.kjycx.2020.12.014

2095－6835（2020）12－0036－02

山西省青年科技研究基金項目（編號：201601D202088）

黃瀟（1984—），女，碩士，副研究員，研究方向為微生物學。

蔡穎慧。

〔編輯：嚴麗琴〕