miR-16 在冠心病患者血清中表達及功能分析

靳 星，李文祎，馬 蓉

(1.隆堯縣醫院檢驗科，河北 邢臺 055350；2.北京大學人民醫院 檢驗科，北京 100044)

微小RNA(microRNA, miR)是屬于小分子非編碼RNA的一種，它們可以通過與靶基因的3'UTR結合抑制其表達。近來研究表明，miR的表達變化與多種疾病相關。在冠心病中，也存在多種上調或下調性變化的miR，它們共同參與該病的調控過程。miR-16是一種廣泛表達的miR，血漿中也可檢測到該miR的表達。研究證實，miR-16的表達在多種疾病，如腫瘤、心肌肥厚、腦中風等[1-3]。在心肌肥厚過程中，miR-16的表達下調，并因此促進靶基因細胞周期蛋白(cyclin)D1、D2、E1表達的上調，加重心肌肥厚[3]。然而，miR-16在血管平滑肌中的作用尚不清楚，本研究分別通過檢測冠心病患者血漿miR-16的表達變化，探討該miR與冠心病的關系，并通過研究該miR對血管平滑肌增殖的影響初步探討該miR的作用機制，旨在為冠心病的診斷、治療提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1研究對象 隨機選取在2016年9月至2017年10月于隆堯縣醫院心內科住院并經冠狀動脈造影確診為冠心病患者43例，男30例，女13例，年齡(65.8±11.3)歲；對照組為同期經心電圖、超聲心動圖等檢測排除心臟疾病，來我院體檢的健康人49例，，男23例，女26例，年齡(60.4±12.8)歲。

1.2樣品采集 各組研究對象均抽取清晨空腹外周靜脈血4 ml，并收集于EDTA-K2抗凝管中。采血后，迅速在4 ℃下以3 000 r/min離心，收集上層血漿，分裝于凍存管中，保存于-80 ℃冰箱保存備用。

1.3血漿miR提取及檢測 采用mirVana血漿miR提取試劑盒，按照使用說明加入線蟲Cel-miR-39類似物作為內參，依據試劑盒的使用說明提取血漿總RNA。用NanoDrop檢測RNA濃度，經過稀釋、濃度矯正后采用ABI公司microRNA逆轉錄試劑盒將各樣品中miR-16和Cel-miR-39進行逆轉錄反應。采用TaqMan探針實時熒光定量PCR法檢測各樣品中miR-16及Cel-miR-39的Ct值，以miR-16與Cel-miR-39的相對Ct值表示miR-16在各樣品中的相對表達強度。按對照組miR-16的相對表達強度進行歸一化處理，觀察各組相對于對照組血漿miR-16的表達變化。

1.4細胞處理與活力檢測 將人臍靜脈血管平滑肌細胞傳代、細胞計數，并稀釋至100 000個細胞/ml的密度，迅速接種于96孔板，每孔100 μl細胞懸液。待細胞貼壁后將細胞培養液血清濃度降至0.1%，以同步化細胞周期。血清饑餓24 h后采用Lipofectamin 3000試劑分別將miR-16類似物及其陰性對照轉染平滑肌細胞。轉染后24 h在相應的細胞中加入PDGF-BB(終濃度10 nmol/L)處理。轉染后48 h，觀察細胞狀態，并在每個孔中加入10 μl的CCK-8試劑，將96孔板再次放入細胞培養箱中孵育2 h，取出觀察細胞懸液顏色變化，放置于酶標儀上并檢測450 nm處吸光度數值。各組的吸光度數值經過歸一化處理后分析其變化情況，并以此表示各組細胞的細胞活力變化。

1.5靶基因檢測 將人臍靜脈平滑肌細胞接種于12孔板，采用Lipofectamin 3000試劑轉染細胞，48 h后收集各組細胞，并采用Western印跡檢測各組細胞中cyclin D1、cyclin D2和cyclin E1的表達強度。具體步驟如下：將各組細胞加入RIPA裂解液，低溫靜置、震蕩，充分裂解，并在4 ℃條件下以12 000 r/min進行離心。取上清液轉移至新的離心管中，采用BCA法進行蛋白定量。定量后，采用RIPA裂解液稀釋至2 μg/μl的工作液，加入5X上樣緩沖液之后，在100 ℃中加熱煮沸5 min。之后，迅速置于冰上降溫，短暫離心后將各組樣品加入到SDS-PAGE膠中進行電泳分離(濃縮膠80 V 30 min，分離膠120 V 60 min)。之后，將膠取出，置于電轉儀上進行恒流電轉膜(300 mA, 120 min)。電轉結束后，取出NC膜，采用麗春紅工作液染色，并采用5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h。封閉結束后，采用含有抗cyclinD1、cyclin D2、cyclin E1及GAPDH的一抗稀釋液(1∶1 000)于4 ℃搖床上緩慢孵育過夜。次日，采用TBST溶液漂洗4次，并用HRP標記的山羊抗兔二抗室溫孵育1 h。采用TBST溶液再次漂洗4次后加入化學發光底物顯色。通過Quantity One軟件拍攝、記錄圖像并掃描各條帶的灰度值。以GAPDH為內參，以上述蛋白與GAPDH灰度的比值計算其相對表達量。

2 結 果

2.1冠心病患者血漿miR-16水平下調 為探討miR-16在冠心病患者中的變化，采用實時熒光定量PCR法檢測血漿標本中該miR的變化。血漿miR-16的表達在冠心病患者中顯著下調(1.00±0.42 vs 0.75±0.23，P<0.05)，表明miR-16表達的下調可能與冠心病有關, 見圖1。

圖1 血漿 miR-16 的表達強度 *與對照組比較P<0.05

2.2miR-16 對血管平滑肌增殖的調控作用 為探討 miR-16 對血管平滑肌增殖的作用，采用 CCK-8 法檢測過表達 miR-16 后血管平滑肌細胞增殖的變化。結果發現，在轉染 miR-16 類似物48 h后，血管平滑肌細胞的增殖活力顯著下降，是對照組的23.1%，見圖 2。在此基礎上采用血小板源生生長因子 PDGF-BB(50 ng/L)刺激血管平滑肌增殖，觀察到過表達 miR-16 類似物的血管平滑肌細胞增殖活力 是陰性對照組的53.8%，表明過表達 miR-16 后可部分對抗 PDGF-BB 誘導的細胞增殖，見 圖 2。采用Western印跡對其靶基因cyclin D1、D2及E1進行檢測，發現過表達miR-16后可顯著降低上述基因的表達，見圖3。

圖2 miR-16 對細胞增殖活力的影響 采用CCK-8檢測細胞的增殖活力

圖3 miR-16 對細胞周期蛋白表達的調控作用 采用蛋白印跡檢測過表達miR-16后血管平滑肌細胞中cyclin D1、D2及E1表達的變化(a)。進行灰度掃描后以GAPDH為內參，計算各組相對表達強度(b)。**與對照組比較P<0.01

3 討 論

miR是一種細胞內的小分子非編碼RNA，其長度大約為21～23 nt。目前的研究發現，miR參與了胞內多種生物學過程的調控，如細胞周期及增殖、凋亡、自噬等[4-8]。初始的miR轉錄產物較長，經胞內酶切處理后形成成熟體的miR。這些miR可與其靶基因的3'UTR結合進而影響后者的表達。目前研究證實，miR主要發揮抑制靶基因表達的功能，在哺乳動物細胞中，3'UTR結合miR后主要通過抑制該靶基因的翻譯而影響其表達。miR是一種小分子調控分子，因此其可以較容易的從細胞內轉移至胞外以及循環血中。相較于大多數RNA分子，miR由于分子量較小而具有較高的穩定性，在轉移至循環血中時可以在較長時間穩定存在。因此，循環血中的miR就有可能被遠隔部位的細胞重新攝取，并轉運至細胞內發揮相應的生物學效應。基于該特性，循環血miR的檢測為疾病的診斷以及疾病發病的分子機制研究提供了新方法[9]。

目前研究表明，多種疾病如心血管疾病、腫瘤等，其患者循環血中特定類型的miR表達均可呈現顯著變化[10-16]。本研究發現，冠心病患者血漿miR-16表達水平呈顯著下調趨勢，由此提示該miR很可能在冠心病發病及進展過程中起到重要的調控作用。

miR-16是一種調控細胞周期的小分子非編碼RNA，其高表達可顯著抑制多種cyclins的表達，進而抑制細胞增殖[1, 17-20]。研究表明，在腫瘤細胞中，miR-16可負向調控cyclin D1、cyclin D2及cyclin E1的表達[3]。我們的研究也發現，在血管平滑肌細胞中過表達miR-16可顯著抑制該細胞增殖，并顯著下調cyclin D1、D2及cyclin E1的表達強度。血管平滑肌細胞過度增殖是冠狀動脈狹窄的病理機制之一。當血管內皮受到氧化應激、炎癥損傷時，其功能紊亂，同時導致血管平滑肌細胞的表型轉換，即由收縮型轉變為分泌型。分泌型的血管平滑肌細胞逐漸失去其原有的形態和功能，獲得細胞增殖、遷移、合成分泌的能力。發生表型轉換后的血管平滑肌細胞合成細胞外基質成分的能力增加，進而加重血管的重塑和管腔狹窄。在本研究中，我們不僅發現在冠心病患者循環血中miR-16出現顯著降低，還發現該miR過表達后抑制了血管平滑肌細胞的增殖以及細胞周期蛋白cyclin D1、cyclin D2及cyclin E1的表達下調。由此提示，該miR很可能發揮了抑制冠心病的作用。通過分子生物學手段阻斷血管平滑肌細胞的增殖很可能是治療冠心病的有效策略。我們的研究表明， 過表達miR-16 后可顯著阻斷血管平滑肌細胞增殖，該過程很可能是通過靶向抑制細胞周期蛋白 cyclin D1、cyclin D2 及 cyclin E1所致。然而，本研究還存在一些局限性：首先，本研究中病例數目較少，需要在更大規模的人群中做相關分析；其次，本研究尚未在動物模型上做相關驗證，尚不能完全闡明miR-16對冠心病發展以及血管平滑肌細胞增殖的直接關系。因此，關于miR-16與冠心病之間的分子機制仍是今后研究的重點。

綜上所述，miR-16 是一種冠心病及血管平滑肌細胞增殖相關 miR-16，其表達在冠心病患者中下調。該 miR可通過抑制多種細胞周期調控蛋白抑制血管平滑肌細胞的增殖，miR-16 很可能是冠心病防治的潛在靶點。