克雷伯氏菌發酵棉稈水解糖液產丁二酸的代謝特性

劉攀攀，崔志勇，王子坤，張琴,3*

1(塔里木大學 生命科學學院，新疆 阿拉爾，843300)2(塔里木大學，分析測試中心，新疆 阿拉爾，843300) 3(塔里木大學，塔里木盆地生物資源保護利用兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾，843300)

丁二酸(succinic acid，SA)是三羧酸循環中重要的中間代謝產物，也是C4平臺重要的化合物，它作為一種重要的有機化工原料，可用于合成1,4-丁二醇、四氫呋喃、丁內酯、α-吡喏烷酮(α-pyrrolidone，NKP)、N-甲基吡咯烷酮及可降解生物高分子材料聚丁二酸丁二醇酯(polybutylene succiante,PBS)等原料，廣泛應用于醫藥、食品、日化、紡織、農業、塑料等工業領域[1-2]。同時，丁二酸也是最重要的積木化學品之一，2004年被美國能源部認定為未來12種潛在的生物基化學品之一[3-8]。由于其多樣化的應用，全球丁二酸市場迅速增長，于建榮等[9]預計2020年丁二酸的產量達7～8萬t，市場價值將達到5.4億美元。近年來，隨著生物工程技術的迅速發展，生物發酵法生產丁二酸因具資源可再生利用等優勢，有較大的發展潛力[10]。較多微生物菌種都可通過一定代謝途徑合成丁二酸，原核微生物中，丁二酸合成的代謝途徑主要有3條：(1)從三羧酸循環的還原性支路合成，在該途徑中，丁二酸從磷酸烯醇式丙酮酸起始經由一些中間代謝物包括草酰乙酸、蘋果酸和富馬酸的轉化而合成；(2)從乙醛酸循環途徑合成，該途徑中，2 mol乙酰CoA轉化合成1 mol丁二酸；(3)從氧化三羧酸循環合成，該途徑從乙酰CoA的轉化開始，依次轉化為檸檬酸、異檸檬酸、丁二酸，合成的丁二酸再在丁二酸脫氫酶的作用下轉化為富馬酸[11]。為此，代謝產物的監測可在一定程度上弄清微生物合成丁二酸的代謝途徑。

克雷伯氏菌是工業生產中重要的發酵菌種，用于多種生物基化學品如1,3-丙二醇、2,3-丁二醇、乙醇、生物氫等的發酵生產中。并且，克雷伯氏菌還有較廣的基質利用特性，尤其是有的野生菌株能利用木質纖維素水解液進行生物基化學品的發酵生產，如CHENG等[12]報道了1株Klebsiellaoxytoca能夠發酵玉米芯酸解液生產2,3-丁二醇，JIANG等[13]報道了1株Klebsiellaoxytoca能夠發酵麻風樹皮酸解液生產2,3-丁二醇。在克雷伯氏菌中，丁二酸是伴隨一些生物基化學品產生的重要代謝物，CHENG等[14]報道了pH值和溶解CO2水平對Klebsiellapneumonia中2,3-丁二醇和丁二酸產量的影響。然而，迄今，較少研究涉及克雷伯氏菌用于生物丁二酸的生產。

棉稈是新疆廣泛存在的生物質原料，近年來棉稈的高值化利用備受關注，棉稈高值化產品的開發也呈現多樣化。在棉稈轉化生產丁二酸的研究中，有學者報道了采用產琥珀酸放線桿菌發酵纖維素酶處理的棉稈纖維用于丁二酸的生產[15-16]，然而，關于微生物共利用棉稈水解糖液中的葡萄糖和木糖生產丁二酸的研究尚未見報道。本課題組在前期研究工作中已分離獲得7株克雷伯氏菌，本研究旨在通過對這些菌株發酵棉稈水解糖液過程中丁二酸產量及其關鍵酶和代謝產物的監測和分析，明晰菌株發酵產丁二酸的代謝途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

由本課題組分離獲得并保藏于塔里木盆地生物資源保護利用兵團重點實驗室的7株克雷伯氏菌，編號分別為WL1305、WL1316、WL1309、WL1312、WL1307、WL1306、WL1315。

1.1.2 原料

新疆阿拉爾市棉田中的棉花秸稈，風干、粉碎后過20目篩備用。

1.1.3 試劑

丁二酸檢測試劑盒、丙酮酸檢測試劑盒、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶檢測試劑盒、乳酸檢測試劑盒、琥珀酸脫氫酶檢測試劑盒、3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)試劑、地衣酚試劑等,上海譽譜化工科技有限公司。

1.1.4 培養基的制備

斜面活化培養基(g/L)：木糖10，葡萄糖10，牛肉膏5，蛋白胨10，NaCl 5，KH2PO40.5，MgSO4·7H2O 1，瓊脂22，pH 7.0，水1 L，110 ℃滅菌30 min。

種子培養基(g/L)：木糖10，葡萄糖10，牛肉膏5，蛋白胨10，NaCl 5，KH2PO40.5，MgSO4·7H2O 1，pH 7.0，水1 L，110 ℃滅菌30 min。

發酵培養基(g/L)：牛肉膏5，蛋白胨10，NaCl 5，KH2PO40.5，MgSO4·7H2O 1，pH 7.0，棉稈的酸解糖液1 L，110 ℃滅菌30 min。棉稈水解糖液初始糖質量分數為5%。

1.2 試驗方法

1.2.1 發酵棉稈酸解糖液的制備

采用實驗室前期優化的酸解方法[17]制備棉稈酸解液：配制體積分數為4%的稀H2SO4，調節固液比為1∶5(g ∶mL)，于121 ℃，103 kPa高溫高壓下水解30 min，抽濾獲得棉稈酸解液。

獲得的酸解液放置于室溫，調節pH值至10.0，4 000 r/min 離心10 min，取上清液，用稀H2SO4回調至pH=5.0，實現其脫毒。所得糖液經脫毒脫色大孔樹脂過濾，即得酸解糖液。

1.2.2 菌株活化、種子制備及發酵培養

斜面活化的菌種，接種于活化培養基中，于37 ℃、180 r/min的搖床中培養12～16 h，調節OD600約為1.0，接種于發酵培養基中，于37 ℃，180 r/min的搖床中發酵培養。分別于6、12、18、24、30、36 h取樣、離心，分別收集上清液和細菌細胞，用于測定丁二酸及其關鍵酶和代謝產物。

1.2.3 克雷伯氏菌發酵棉稈水解糖液還原糖及丁二酸測定

葡萄糖含量采用DNS比色法測定[18],木糖含量采用地衣酚試劑比色法測定[19],丁二酸含量采用丁二酸試劑盒測定;乳酸含量通過乳酸含量試劑盒檢測；丙酮酸含量通過丙酮酸含量測定試劑盒檢測；琥珀酸脫氫酶活性通過琥珀酸脫氫酶試劑盒檢測；磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性通過磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶試劑盒檢測。

2 結果與分析

2.1 丁二酸產量及還原糖利用率的結果分析

檢測了7株克雷伯氏菌在發酵6、12、18、24、30和36 h的丁二酸含量，結果如圖1所示。

圖1 七株細菌發酵液中的丁二酸含量Fig.1 Succinic acid content of the seven strains in the fermentation broth

由圖1可知，7株克雷伯氏菌在6～36 h均能有效發酵棉稈水解糖液產丁二酸。其中，菌株WL1309和WL1312在發酵早期(6 h)即獲得了較高的丁二酸產量，此時的丁二酸含量均達42 g/L以上，之后丁二酸產量有一定降低。其余5株細菌在發酵12 h的丁二酸含量均達峰值，表明了這些菌株在較早期(12 h)產丁二酸的特性，可見這7株克雷伯氏菌在發酵產丁二酸的時間集中于6～12 h，為此，可初步推測，這些菌株可能通過還原性三羧酸循環途徑產丁二酸。在發酵18～36 h，大多數菌株所產丁二酸均有一定降低(WL1307除外)，大多數低于20 g/L，有的甚至低于10 g/L，可推測，這些菌株所產丁二酸可能在三羧酸循環途徑中較多地轉化，為此，調控發酵時間對于高產量丁二酸的獲得至關重要。

這7株克雷伯氏菌在發酵過程均能有效利用棉稈水解糖液中的葡萄糖和木糖。由圖2可知，至發酵結束(36 h)，這7株菌已利用了棉稈水解糖液中大多數的葡萄糖和木糖，其葡萄糖利用率均高于85%，木糖利用率均高于90%，由此可見，這些菌株對棉稈水解糖液中葡萄糖和木糖的利用能力均較高。

圖2 七株細菌發酵結束的還原糖利用率Fig.2 Utilization rate of reducing sugar at the end of fermentation of seven bacria

2.2 克雷伯氏菌發酵棉稈水解糖液產丁二酸過程中關鍵酶活性分析

2.2.1 琥珀酸脫氫酶活性的結果分析

琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase)是檸檬酸循環中唯一與膜結合的不溶性酶，也是連接呼吸電子傳遞和氧化磷酸化的樞紐之一，琥珀酸在琥珀酸脫氫酶的作用下被氧化生成延胡索酸，因此，作為一種直接作用于琥珀酸的不可逆性酶，它的活性高低直接影響合成丁二酸的含量[20]。

由圖3可知，7種克雷伯氏菌在6～36 h的琥珀酸脫氫酶均有一定的活性，但相對較低，都在0～0.005 5 nmol/(min·104cell)，其中，WL1305、WL1316、WL1309在6～36 h時發酵過程中均有一定的峰值，說明該酶在某一時間段均有促進丁二酸轉化為延胡索酸的能力，不利于丁二酸的積累，因此，需嚴格控制發酵時間，減少發酵過程中丁二酸的轉化。而WL1312、WL1307、WL1306、WL1315在6～36 h整個發酵時間段酶的活性均較低，顯示其對菌株發酵過程中丁二酸的產量影響較小。

圖3 七株菌發酵產丁二酸過程中的琥珀酸脫氫酶活性Fig.3 Succinic acid dehydrogenase activity during fermentation of succinic acid by seven strains

2.2.2 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性結果分析

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase，Pepck)是丁二酸代謝途徑中的關鍵酶，與CO2反應生成草酰乙酸呈不可逆反應的酶。它的活性直接影響磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate,Pep)與草酰乙酸之間代謝流的暢通，從而影響產丁二酸的含量[21]。

結合圖3、圖4可知，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性遠遠高于琥珀酸脫氫酶的活性，其中，7株菌在24～36 h 活性有顯著增加的趨勢，說明在這一時間段該酶有利于磷酸烯醇式丙酮酸脫羧形成草酰乙酸，但這一時間段7株菌(WL1307除外)產丁二酸的能力均下降，推斷可能是因為磷酸烯醇式丙酮酸經過磷酸烯醇式丙酮酸脫羧酶作用下形成草酰乙酸后，促進了三羧酸循環的進行，競爭了還原性三羧酸循環生成丁二酸。

圖4 七株菌發酵產丁二酸過程中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性Fig.4 Phosphoenolpyruvate carboxylase activity during fermentation of succinic acid by seven strains

2.3 克雷伯氏菌發酵棉稈水解糖液產丁二酸過程中主要代謝產物分析

2.3.1 菌株細胞內外丙酮酸濃度分析

丙酮酸是聯系細胞代謝的關鍵節點化合物。由圖5-a可知，7株細菌細胞內的丙酮酸含量在發酵36 h內均較低，大多數菌株在12～18 h達到一個峰值，之后有一定降低，最后有一定升高，表明丙酮酸節點處的代謝流分布受諸多代謝途徑的影響，隨著時間的增加有明顯升高的趨勢，在36 h時含量較高，都高于1.1 μg/104cell，表明克雷伯氏菌在這一點是利用棉稈水解液進行糖酵解產丙酮酸的關鍵時間點，更有利于進行三羧酸循環從而轉向丁二酸，而在0～30 h丙酮酸的濃度總體偏低，說明在此期間還原糖通過其他途徑進行代謝產丁二酸，從而降低了丙酮酸的濃度。由圖5-b可知，7株克雷伯氏菌細胞外的丙酮酸含量從總體來看均較高，高于80 mg/L，并且隨著時間的增加呈梯度緩慢上升，至發酵后期(30～36 h)，其含量已達140 mg/L以上。因此，丙酮酸作為還原性三羧酸循環中丁二酸合成的競爭代謝產物及氧化性三羧酸循環中丁二酸合成和轉化的關鍵化合物，其高濃度在發酵早期(6～12 h)可能開始競爭丁二酸合成支路的代謝流分布，而在發酵的中后期(24～36 h)，使得較多的代謝流分布于氧化性三羧酸循環，這時丁二酸有一定積累，但仍在加速轉化，導致丁二酸的濃度并不會太高，甚至有降低的趨勢。

a-胞內丙酮酸濃度；b-胞外丙酮酸濃度圖5 七株菌發酵產丁二酸過程中的胞內外丙酮酸濃度Fig.5 Intracellular and extracellular pyruvate concentration during fermentation of succinic acid by seven strains

2.3.2 細胞內外乳酸濃度的分析

由圖6-a可知，7株細菌細胞內的乳酸濃度在全發酵周期內非常低，尤其在6～12 h與24～36 h兩個時間段，7株細菌細胞內乳酸濃度幾乎接近0，而在12～24 h出現一個峰值，由此表明，盡管菌株細胞內乳酸含量極低，但在發酵12～24 h仍有一定積累。由圖6-b可知，7株克雷伯氏菌的胞外乳酸含量從整體來看仍然不高，除WL1315以外，其余6株細菌細胞外的乳酸濃度都在0～15 mmol/L，只是在發酵過程中有一定的積累，處理一定峰值(WL1309、WL1307和WL1315有2個峰值)。從這些菌株胞內外乳酸濃度來看，總體都不高，表明乳酸發酵途徑在發酵0～36 h，對丁二酸的競爭作用并不算太強，對丁二酸合成支路代謝流分布的競爭作用相對較弱。

a-胞內乳酸濃度；b-胞外乳酸濃度圖6 七株菌發酵產丁二酸過程中的胞內外乳酸濃度Fig.6 Intracellular and extracellular lactic acid concentration during fermentation of succinic acid by seven strains

3 結論

本文研究了克雷伯氏菌發酵棉稈水解糖液產丁二酸代謝的特性，通過對菌株發酵過程中丁二酸含量、葡萄糖和木糖利用率、丙酮酸含量、乳酸含量及關鍵酶活性的測定、利用及分析，弄清了這些克雷伯氏菌發酵棉稈產丁二酸的主要代謝途徑及其競爭代謝支路。獲得的結論如下：

(1)7株克雷伯氏菌在6～36 h均能有效發酵棉稈水解糖液產丁二酸，且其在發酵早期(6～12 h)獲得的丁二酸產量最高，在發酵過程中能有效利用棉稈水解糖液中葡萄糖和木糖，至發酵結束(36 h)，這7株菌的葡萄糖利用率均高于85%，木糖利用率均高于90%。

(2)7株克雷伯氏菌在發酵產丁二酸過程中，琥珀酸脫氫酶活性均較低，而磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性較高，并且在發酵6～12 h及24～36 h對丁二酸合成的影響較強，表明其在發酵早期(6～12 h)可能促進了丁二酸在還原性三羧酸循環途徑的合成，而在發酵后期(24～36 h)，因其產物(草酰乙酸)的消耗，加之丙酮酸節點高的代謝流分布，則加速了丁二酸的轉化。

(3)7株克雷伯氏菌細胞外發酵液的丙酮酸含量從總體來看均較高，尤其在發酵后期其質量濃度已達140 mg/L以上，從其濃度變化可推測，丙酮酸節點可能在發酵中后期(24～36 h)加速了丁二酸的轉化，引起丁二酸合成支路代謝流分布的降低。相較而言，7株細菌胞內外乳酸濃度在發酵過程中均不高，只是在一定發酵階段有一點積累，但其對丁二酸合成支路代謝流分布的影響仍較弱。

4 討論

丁二酸是許多厭氧和兼性厭氧微生物的發酵終產物之一。目前研究的工業菌株主要有厭氧的谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)[22]和厭氧螺菌(Anaerobiospirillumsucciniciproducens)[23]、兼性厭氧放線桿菌(Actinobacillussuccinogenes)[24]和大腸桿菌(Escherichiacoli)[25]。其發酵方式分為兩種：(1)好氧發酵。在有氧的狀況下，菌株具有較快的生長和代謝速率，但到菌株穩定期發酵時由于溶氧不足會使產酸速率降低及副產物增加；(2)厭氧發酵。發酵需絕對厭氧，條件較為苛刻，碳源利用緩慢，發酵周期較長，但丁二酸轉化速率高。本研究采用兼性厭氧菌—克雷伯氏菌進行發酵棉稈水解糖液產丁二酸的整個過程中，發現丁二酸含量在發酵前期較高，到后期有所降低，根據關鍵酶及發酵產物的變化，推測原因是發酵前期沒有代謝流的競爭，主要是通過還原性三羧酸循環途徑進行，到后期在磷酸烯醇式丙酮酸脫羧酶作用下形成草酰乙酸后，促進了三羧酸循環的進行，使得丁二酸在三羧酸循環途徑中較多地轉化從而降低了丁二酸的產量。因此，在發酵過程中，控制發酵時間是至關重要的。此外，對于細胞代謝的丙酮酸節點，細胞外的含量遠高于細胞內，但總體上來看，都呈現上升的趨勢，推測在發酵早期(6～12 h)，氧化性三羧酸循環已經開始競爭丁二酸合成支路的代謝流分布，在發酵的中后期(24～36 h)，由于較多的代謝流分布于氧化性三羧酸循環，并且有少量的乳酸副產物的產生，使得后期丁二酸的濃度有降低的趨勢。