一株亞硒酸鈉還原菌的分離及納米硒表征

曾儀維，張小萱，程思俊，劉歡，閔婷，梅運軍

(武漢輕工大學 化學與環境工程學院，湖北 武漢，430023)

硒為人體必須的微量元素之一，它在機體內有諸多生物學功能，如抗氧化、細胞修復、增強免疫力以及防癌等[1-3]；人體缺硒會引起臟器機能失調，引發各種疾病[4-6]。以克山病為例，患者主要表現為急性或慢性心功能不全、心臟擴大、心率失常等。調查顯示，克山病發生在低硒地區，患者血液及毛發中的硒含量明顯低于非病地區，口服含硒產品能起到預防克山病的效果，但長期食用含硒量較高的食物會引起硒慢性中毒。中國營養學會針對不同人群制定了硒安全攝入量，建議成人硒最高攝入量為400 μg/d，推薦攝入量為50～250 μg/d，兒童為20～50 μg/d，普通癌癥患者為200～400 μg/d[5]。

由于人體不能直接合成硒，通過飲食攝取硒是唯一途徑。不同形態的硒在人體內的吸收、生物效應及毒性等也不同。常見的補硒產品大致分為兼具活性與毒性的硒化合物和毒性低的零價硒。有機硒類補硒品相對于無機硒來說，其生物活性和毒性有很大的改善，但其仍然面臨諸多問題，如生物安全性、生產成本等制約了有機硒產品的進一步開發[7]。納米尺寸單質硒的出現為硒類產品進一步研發帶來了新的曙光，其主要由化學法和生物合成法合成。用化學方法合成的元素硒呈紅色、灰色、褐色或黑色，且顆粒粗大的紅色單質硒易聚合轉變成灰色或黑色單質硒；生物合成納米硒呈紅色膠體狀，這種納米硒是以蛋白質為核、紅色單質硒為膜和以蛋白質為分散劑的納米顆粒[8]。由于化學方法制備得到的紅色單質硒一般粒徑較大，且容易聚合而不穩定，人們開始研究控制單質硒聚合的方法制備出了納米硒，有研究表明納米硒在100～500 nm有助于植物、動物、人類和微生物對硒的吸收[9]。

研究顯示，微生物細胞能將硒酸鈉或亞硒酸鈉還原為納米硒[10]。OREMLAND等[11]于2004年利用厭氧菌將有毒性的硒轉化成毒性低的納米硒；2010年蔣東華[12]及FESHARAK等[13]分別完成了納米單質硒的生物轉化。不同微生物還原亞硒酸鈉生成納米硒的粒徑會有不同，劉紅芳[7]利用乳酸菌LA4將亞硒酸鈉還原為紅色納米的粒徑在50～200 nm；李利軍等[14]利用解淀粉芽孢桿菌Lxz-41合成納米硒的粒徑在300 nm左右。除了利用微生物細胞合成納米硒外，微生物胞外聚合物也有還原亞硒酸鈉為納米硒的能力[15]。

鑒于納米硒比其他形式的硒具有更高的生物活性和更低的毒性，使其在醫藥保健品市場上具有更大的吸引力與競爭力，可以預料，納米硒將具有強大的發展潛力和應用前景。國外在利用微生物硒還原方面研究較多，而國內在這方面研究相對較少；因此，發掘更多、更安全的生物納米硒轉化菌具有重大的經濟效益和社會意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料

土樣，2018年4月在湖北恩施州漁塘壩富硒礦區采集。采集后的土樣用無菌離心管封裝并于4 ℃條件下運至實驗室用于立即處理。

1.1.2 試劑

酵母抽提物、蛋白胨，OXIOD；瓊脂粉，Biosharp；亞硒酸鈉，Alfa；其他試劑購自國藥集團(分析純)。

1.1.3 培養基

亞硒酸鈉還原菌篩選培養基：向LB培養基中添加1 g/L的亞硒酸鈉，制備液體和固體培養基；

亞硒酸鈉耐受性測試培養基：向LB培養基中添加亞硒酸鈉到指定濃度，制備液體培養基。

1.2 儀器與設備

AXIS Ultra DLD X射線光電子能譜儀，日本島津公司；JEOL 7600F掃描電鏡，日本電子公司；FA-45-12-17 eppendorf離心機，德國艾本德公司；D-1A-50真空冷凍干燥機，江蘇天翎儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 亞硒酸鈉還原菌的分離純化

取1 g采集的土壤樣品置于含10 mL LB的試管中，用ABSON渦旋儀充分振蕩，轉速為2 000 r/min，然后進行梯度稀釋。稀釋后的樣品涂布于富集培養基上，于30 ℃恒溫培養箱內培養72 h后觀察菌落顏色。挑選紅色菌落進行復篩，得到純化的亞硒酸鈉還原菌用于后續實驗。

1.3.2 亞硒酸鈉還原菌對亞硒酸鈉耐受性分析

取1株上述純化后的亞硒酸鈉還原菌經LB液體培養基活化后按2%的接種量接種至相應的耐受性測試培養基，培養5 d，每天觀察菌體生長與納米硒的生成狀況。

1.3.3 亞硒酸鈉還原菌形態

經LB培養基活化的亞硒酸鈉還原菌離心，按照梁靜南等[16]的方法制備樣品進行掃描電鏡測試。

1.3.4 亞硒酸鈉還原菌鑒定

提取活化后亞硒酸鈉還原菌基因組，送生工生物工程(上海)股份有限公司進行16S rRNA測序；測序結果經BLAST比對后利用MEGA 6.0軟件構建系統發育樹。

1.3.5 納米硒的純化及表征

1.3.5.1 納米硒的純化

在含亞硒酸鈉(10 mg/mL)的LB培養基中按照2%的接種量接種新鮮亞硒酸鈉還原菌的培養物，在30 ℃恒溫搖床中培養，轉速為180 r/min；培養36 h后在6 000×g下離心收集沉淀物。

50 mL培養物形成的沉淀重懸于2 mL的無菌水中，將重懸物移至預制的蔗糖密度梯度管中(由質量分數50%、60%、70%三個梯度的蔗糖制備)，8 000×g離心10 min后，收集離心管底部紅色沉淀。

1.3.5.2 納米硒的表征

納米硒掃描電鏡測試：按照1.3.5.1的方法制備的納米硒在冷凍干燥機上干燥48 h，干燥后的樣品在掃描電鏡上進行測試。

納米硒X射線光電子能譜發(X-ray photoelectron spectroscopy, XPS)分析：按照1.3.5.1方法制備的納米硒在冷凍干燥機上干燥48 h，干燥后的樣品進行XPS分析；不添加亞硒酸鈉的LB培養基培養菌體，離心收集菌體且冷凍干燥后進行XPS測試作為對照。掃描電鏡及XPS分析委托武漢鑠思百檢測技術有限公司進行測試。

2 結果與分析

2.1 亞硒酸鈉還原菌的分離純化

樣品土壤重懸并稀釋涂布于亞硒酸鈉還原菌的篩選培養基上，培養72 h后挑選紅色單菌落在同樣的培養基上進行復篩，所得結果如圖1所示。在初篩平板上出現了紅色菌落和白色菌落(圖1-a)，紅色菌落作為亞硒酸鈉還原菌的候選菌株。挑選初篩平板上較大的紅色單菌落重懸后進行復篩，復篩平板上所有菌落呈現紅色且較初篩平板上的菌落顏色深(圖1-b)。從平板篩選的結果可以看出，純化后的菌落能將亞硒酸鈉還原為紅色產物，該菌作為制備生物活性納米硒的候選菌株。

a-初篩平板; b-復篩平板圖1 亞硒酸鈉還原菌的分離純化Fig.1 Isolation and purification of selenite reducting bateria

2.2 亞硒酸鈉還原菌對亞硒酸鈉耐受性分析

挑選復篩平板上菌落較大的菌株進行活化，活化后的納米硒還原菌候選株培養物按照2%的接種量接種到含不同質量濃度的亞硒酸鈉耐受性測試培養基中，連續培養5 d并觀察，結果如圖2所示。結果顯示，0 d，各培養瓶中菌液顏色一致；1 d后，未添加亞硒酸鈉的培養基中菌體生長迅速，培養基明顯渾濁，而添加了亞硒酸鈉的培養基仍然澄清；2 d后，含10 mg/mL亞硒酸鈉的培養瓶中呈現紅色，而亞硒酸鈉其他濃度的培養瓶中無明顯變化；3～4 d后，在10 mg/mL亞硒的培養瓶呈現深紅，其他各濃度的培養物(除0 mg/mL亞硒酸鈉)中略顯紅色，不含亞硒酸鈉添加物的培養物呈現乳白色，為菌體本身顏色； 5 d后，含20 mg/mL亞硒酸鈉的培養瓶呈現暗紅且三角瓶底部有灰色沉淀物，推測灰色沉淀物是由于納米硒顆粒團聚造成[8]，而其他各培養瓶較4 d培養物未出現明顯變化。5 d連續觀察發現，在實驗濃度范圍內當亞硒酸鈉質量濃度為5～10 mg/mL時菌體生長良好，當亞硒酸鈉濃度高于10 mg/mL時菌體受到抑制，當濃度高于20 mg/mL時菌體幾乎不生長；結果說明菌株對亞硒酸鈉的耐受性在10～20 mg/mL，該菌株較現有已報道的菌株對亞硒酸鈉有較高的耐受性[12,14, 17-18]，有利于生物制備納米硒。

圖2 亞硒酸鈉還原菌對亞硒酸鈉耐受性測試Fig.2 Assay of the selenite tolerance by the selenite reducting bacterium

2.3 亞硒酸鈉還原菌形態

圖3展示了亞硒酸鈉還原菌的菌落形態及菌體的掃描電鏡結果。圖3-a顯示亞硒酸鈉還原菌菌落光滑、呈乳白色、易挑起；從掃描電鏡圖(圖3-b)可以看出，亞硒酸鈉還原菌為桿狀菌,形態均一，長約2 μm，寬約0.8 μm。

a-亞硒酸鈉還原菌菌落; b-亞硒酸鈉還原菌電鏡圖圖3 亞硒酸鈉還原菌菌落及掃描電鏡圖Fig.3 Colonies and scanning electronic microscopy of the selenite reducting baterium

2.4 亞硒酸鈉還原菌鑒定

從生工生物工程(上海)股份有限公司獲得該菌株的16S rRNA序列并提交至GenBank，獲得序列號為MN853382。利用BLAST軟件進行序列比對，比對結果利用MEGA6.0軟件構建系統發育樹，如圖4所示。圖中標記為目的菌株，根據系統發育樹(Neighbor-Joining法構建)結果，鑒定為Pseudomonassp.，即本研究分離獲得的菌株為1株具有亞硒酸鈉還原性的假單胞菌屬菌株。

圖4 亞硒酸鈉還原菌的系統發育樹Fig.4 The phylogenetic tree of the selenite reducting bacterium

2.5 納米硒的純化及表征

2.5.1 納米硒的純化及電鏡表征

按照1.3.5.1的方法對培養物進行蔗糖密度梯度離心，培養物中紅色顆粒沉積在離心管底部，微生物細胞彌散在離心管的中部區域，呈現乳白色，如圖5-a所示。收集離心管底部的紅色沉淀，冷凍干燥后低溫保存用于后續分析。

圖5-b為培養物常規離心收集沉淀物經冷凍干燥后的樣品掃描電鏡圖，從圖中可以觀察到培養物中生成的納米硒附著在菌體表面，呈聚集狀，顆粒為球形，粒徑主要分布在100～200 nm，納米硒顆粒粒徑與劉紅芳[7]、王東亮等[19]報道基本一致；納米顆粒中出現少量團聚(圖中白色箭頭所示)，團聚體粒徑在500～1 000 nm。圖5-c為培養物常規離心收集沉淀物后再經蔗糖密度梯度離心，收集底部沉淀物冷凍干燥后的樣品掃描電鏡圖，顆粒呈球形，粒徑在100～200 nm；經蔗糖密度梯度離心后的產物純度高，未見完整細胞及細胞碎片。該結果表明，蔗糖密度梯度離心適合用于納米硒的分離純化。納米硒粒徑大小在100～500 nm有利于植物、動物、人類和微生物對硒的吸收[8]，因此，本研究中生物轉化的納米硒能有較好的生物活性。

a-蔗糖密度梯度離心; b-未梯度離心培養物電鏡圖; c-密度梯度離心后的培養物電鏡圖圖5 納米硒的純化及電鏡圖Fig.5 Purification and SEM of nano-selenium

2.5.2 納米硒的XPS分析

采用XPS測試確定硒元素的價態。圖6-a和圖6-b分別為不添加亞硒酸鈉培養的菌體XPS全掃描圖譜及硒元素3d的圖譜，全掃描圖譜和硒元素3d的XPS圖譜中均未出現硒元素的峰，說明樣品中不含硒元素；而純化后的沉淀物的XPS全掃描圖譜(圖6-c)硒元素3d的XPS掃描圖譜(圖6-d)均出現了硒元素的特征電子結合能峰，且硒元素3d的特征峰值在56.24 eV處。據劉紅芳[7]、HAN等[20]報道，單質硒的電子束縛能位于54.6～57.5 eV，由此可推斷本研究分離得到的假單胞菌能將亞硒酸鈉中的硒(Ⅳ)轉化為單質硒。

3 結論

本研究從湖北省恩施州富硒礦區的土壤中分離到了1株具有將亞硒酸鈉還原為紅色產物能力的菌株，初步鑒定為假單胞菌(Pseudomonassp.)。通過對該菌亞硒酸鈉耐受性測試表明，該菌的耐受在10～20 mg/mL；電鏡及XPS分析表明，紅色產物為納米單質硒，呈球形，粒徑在100～200 nm；實驗結果也表明，蔗糖密度梯度離心為納米硒的分離提供了很好的途徑。該假單胞菌菌株作為生產紅色納米單質硒的菌株具有非常好的前景，可為硒的生物轉化提供參考。

a-菌體的XPS全掃描圖譜;b-菌體的硒3d XPS掃描圖譜；c-純化后納米硒的XPS全掃描圖譜；d-純化后硒3d的XPS掃描圖譜圖6 納米硒的XPS測試Fig.6 XPS analysis of nano-selenium