鋅加VC復合配方緩解環磷酰胺誘導的幼齡小鼠免疫抑制

陳瓊，陳朋，徐旻珺，李俊穎

(仙樂健康科技股份有限公司，廣東 汕頭，515041)

人體的免疫器官從出生開始發育，至青春期基本完善。人體的免疫系統由免疫器官、免疫細胞和免疫分子組成，與成人相比，兒童免疫系統有以下發育特點[1]：(1)非特異性免疫的屏障功能低下；(2)單核細胞因缺乏輔助因子，其趨化、吞噬、產生細胞因子和抗原提呈能力低下；(3)胸腺在發育過程中逐漸增大，到青春期才發育成熟，此過程中易發生細胞免疫缺陷[2-3]； (4)分泌免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)和免疫球蛋白A(immunoglobulin A，IgA)的B細胞數量分別在2歲和5歲時達到成人水平。上述特點均可造成幼兒免疫力低下。

鋅是人體中含量僅次于鐵的第二大微量金屬元素，是蛋白質結構和功能的重要組成部分，是涵蓋6大類(水解酶、轉移酶、氧化還原酶、連接酶、裂解酶和異構酶)近2 000個酶的催化組件[4]。更重要的是，鋅指轉錄因子能夠激活下游基因轉錄，而鋅對于維持鋅指蛋白的結構至關重要[5]。因此，鋅是RNA轉錄、細胞生長代謝等生理過程中必不可少的營養元素。據估計，全球缺鋅的患病率為17%～20%，其中絕大多數發生在非洲和亞洲的發展中國家[6-7]。缺鋅會導致免疫系統功能低下，表現為胸腺萎縮，淋巴細胞數量減少和淋巴細胞應答障礙[8]。因此在兒童生長過程中，鋅對于免疫系統的發育是至關重要的。

微量元素在免疫反應的每個階段都發揮著重要的協同作用，充足的劑量對維持屏障功能以及免疫細胞的正常功能至關重要。早在1753年就有文獻記載,補充含豐富VC的柑橘水果的男性壞血病患者康復率較普通飲食患者有顯著增高[9]。之后陸續有研究發現VC還可以促進免疫細胞分化和增殖[10-12]，增強自然殺傷細胞(natural killer cell，NK)活性和趨化性[11,13-14]，增強巨噬細胞的吞噬作用。此外VC還具有抑制活性氧生成，調節細胞因子分泌，清除壞死的中性粒細胞等多種提高免疫的功效[12]。然而，支持免疫功能所必需的每日VC起效量普遍高于目前推薦的膳食攝入標準，諸如有研究表明10～18歲的男性VC的攝入量往往達不到免疫系統發育要求[15]，因此通過營養補充劑攝取充足的微量元素是促進免疫系統發育的有效途徑。綜上所述鋅和VC單獨攝取均有助于增強免疫功能。然而，對于兒童發育期間的免疫力低下問題，有關鋅與VC復合作用的研究還較為匱乏。

環磷酰胺是化療中常用的烷基化劑，具有骨髓抑制和細胞毒性，并且可以通過使輔助性T細胞1(thelper-1 cell，Th1)/輔助性T細胞2(thelper-2 cell，Th2)發生細胞偏倚，誘導免疫抑制[16-17]。還有研究表明，環磷酰胺可以通過抑制T細胞的增殖，降低Th1細胞分泌細胞因子(TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-12)和Th2細胞分泌細胞因子(IL-4、IL-6、IL-10)水平，誘導免疫抑制[18-19]。此外，環磷酰胺還可降低免疫球蛋白(IgA、IgM、IgG)及血清血紅蛋白水平，導致脾臟和胸腺的損傷。

因此，本研究為了開發可作為功能食品成分的潛在免疫增強劑，基于幼齡小鼠，以環磷酰胺誘導免疫抑制動物模型，研究鋅與VC復合配方在緩解免疫抑制功能方面的機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實驗動物

BALB/c小鼠，3周齡，體重(13.13±2.0) g，由廣東省醫學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號SCXK(粵)2013—0002，實驗動物質量合格證號No.44007200058796。動物實驗環境：廣東省中醫藥工程技術研究院SPF級動物實驗室，設施使用許可證號SYXK(粵)2015—0059。飼養條件為12 h/12 h明暗節律、溫度22 ℃、相對濕度55%、換氣次數16 次/h，小鼠自由攝食、飲水。

1.1.2 材料及試劑

VC(含量≥99%)和檸檬酸鋅(鋅含量≥31.5%)復合配方由仙樂健康科技股份有限公司提供。

ELISA試劑盒，天津安諾瑞康生物技術有限公司，抗體，Affymetrix Inc.公司。

JJ3000動物電子秤，G&G公司；Class II Type B2型生物安全柜，新加坡Esco公司；Cellometer Mini型自動細胞計數儀，美國Nexcelom公司；BSA224S型電子分析天平，德國Sartorius公司；5424型小型高速離心機，德國EPPendorf公司；Milli Q Plus型超級純水儀，美國MilliPore公司；3111型CO2細胞培養箱、702型超低溫冰箱、Varioskan Flash型全波長多功能酶標儀，美國Thermo公司；Cytomics FC500MPL型流式細胞儀，美國Beckman Coulter公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型建立與分組

3周齡BALB/c小鼠36只，適應1周后隨機分為空白組(control)、模型組(CTX)、復合配方組(CTX+complex)，每組各12只，雌雄各半。飼養期間，小鼠自由進食、飲水。復合配方組按檸檬酸鋅(以鋅計)5.3 mg/(kg·d)、VC50.5 mg/(kg·d)混合而成。復合配方組小鼠按照20 mL/(kg·d)的體積進行灌胃，空白組和模型組以等體積蒸餾水進行灌胃，每日灌胃1次，實驗周期為28 d。在給藥的第14天，模型組及復合配方組小鼠進行環磷酰胺[40 mg/(kg·d)]腹腔注射，連續注射2 d。在第29天，用戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉后采血，采血后，在麻醉狀態下頸椎脫臼法處死，摘取臟器組織(圖1)。

圖1 實驗日程計劃Fig.1 Experimental protocol

1.2.2 取材

一部分全血在4 ℃ 7 500 r/min離心15 min，收集上清液用于檢測血清IL-2、IL-4、TNF-α及IFN-γ含量，剩余全血在24 h內檢測淋巴細胞數。

取血完畢后，完整解剖摘取胸腺、肝臟、脾臟，去除脂肪和筋膜組織后稱重，并清點派氏結數量。取出靠近十二指腸段的空腸約5 cm，刮取腸黏膜內容物，溶于磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)中，所得溶液用于分泌型免疫球蛋白A(secretory immunglobulin，SIgA)含量的測定。根據公式(1)～公式(3)計算胸腺系數、肝臟系數、脾臟系數：

(1)

(2)

(3)

1.2.3 脾臟細胞懸液制備方法

無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank′s液的小平皿中，并在脾上面放置一塊紗布，用大號注射器內芯輕輕將脾磨碎，制成單個細胞懸液。經200目篩網過濾，用Hank′s液洗2次，每次離心10 min(1 000 r/min)。棄上清將細胞漿彈起，加入0.5 mL滅菌水20 s，裂解紅細胞后再加入0.5 mL 2倍Hank′s液及8 mL Hank′s液，1 000 r/min，離心10 min，然后將細胞懸浮于2 mL的完全培養液中，用全自動細胞計數儀計數脾細胞數量。

1.2.4 脾臟淋巴細胞檢測

將脾臟淋巴細胞稀釋至1×107個/mL，取100 μL加入流式管中。在流式管中再加入CD3+、CD4+和CD8+單克隆抗體各2 μL，旋渦混勻，于4 ℃避光染色后，用PBS洗滌2次，棄去上清，再用PBS重懸細胞，使用流式細胞儀進行檢測,檢測結果用FlowJo軟件進行分析。

1.2.5 NK細胞活性測定方法

取靶細胞(YAC-1細胞)和效應細胞(脾臟細胞)各100 μL(效靶體積比50∶1)，加入U型96孔培養板中；靶細胞自然釋放孔加靶細胞和培養液各100 μL，靶細胞最大釋放孔加靶細胞和1%(體積分數)NP40或2.5%(體積分數)Triton各100 μL；上述各項均設3個復孔，于37 ℃、5%(體積分數)CO2培養箱中培養4 h，然后將96孔培養板以1 500 r/min離心5 min，每孔吸取上清100 μL置平底96孔培養板中，同時加入LDH基質液100 μL，反應3 min，每孔加入1 mol/L的HCl 30 μL，在酶標儀490 nm處測定光密度值(OD)。

NK細胞活性計算如公式(4)所示：

(4)

1.2.6 溶血空斑數檢測方法

參照《保健食品檢驗與評價技術規范》中方法取小鼠脾細胞進行溶血空斑試驗[17]。

1.2.7 外周血淋巴細胞

全血在24 h內用全血細胞分析儀檢測淋巴細胞數。

1.2.8 外周血細胞因子及SIgA檢測

血清和腸黏膜內容物溶液采用酶聯免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) 測定。按照說明書取適量血清(無需稀釋)和腸黏膜內容物溶液按說明書要求用量依次加入ELISA微孔板中。將微孔板置于37 ℃保溫箱中孵育60 min后棄去孔中液體并反復沖洗5次，充分拍打棄盡孔中殘液。分別向孔中依次加入TMB Ⅰ和TMB Ⅱ各50 μL，室溫下避光反應20 min，加入終止液50 μL，充分混勻，終止反應。使用酶標儀在450 nm下讀取各孔吸光度。

1.3 統計學處理

使用SPSS 20.0軟件進行數據分析，采用單因素方差分析進行差異分析，判斷出方差齊性時采用Bonferroni分析，方差不齊時采用Dunnett T3分析。統計結果均以均數±標準差(mean±SD)表示。當P<0.05時，說明數據具有統計學差異。

2 結果與分析

2.1 鋅加VC復合配方對小鼠體重及免疫器官重量的影響

如表1所示，小鼠體重、肝臟質量、肝臟系數各組間無顯著差異。模型組對比空白組，小鼠的脾臟質量有減輕趨勢；脾臟系數顯著降低；復合配方組有緩解脾臟系數降低的趨勢，與空白組和模型組比較均無顯著差異。模型組胸腺質量和胸腺系數較空白組均顯著降低，復合配方組顯著緩解了環磷酰胺造成胸腺質量及胸腺系數降低。以上結果表示鋅加VC復合配方部分緩解了環磷酰胺造成的免疫器官萎縮。

表1 鋅加VC復合配方對小鼠體重及免疫器官重量的影響Table 1 The effect of zinc and VC compound formula on body weight and viscera coefficient in immature mice

2.2 鋅加VC復合配方對外周血細胞因子含量的影響

如圖2所示，與空白組相比，模型組外周血中的Th1細胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ，Th2細胞因子IL-4在外周血中的含量均顯著降低；與模型組相比，復合配方組中IL-2和TNF-α的含量顯著升高，IFN-γ含量呈上升趨勢；而復合配方組外周血中IL-4的含量，與空白組相比顯著降低，和模型組相比無顯著差異(圖2-d)。

以上結果表明鋅加VC復合配方抑制了環磷酰胺造成的Th1細胞因子分泌障礙，對Th2不起效果。

a-IL-2;b-TNF-d;c-IFN-γ;d-IL-4圖2 鋅加VC復合配方對外周血細胞因子含量的影響Fig.2 The effect of zinc and VC compound formula on cytokines content in immature mice serum注：n=12/組; *, P<0.05; **, P<0.01; ***,P<0.001(下同)

2.3 鋅加VC復合配方對脾臟T細胞數量的影響

如圖3-a所示，標記脾臟T細胞數量的CD3+比例在模型組顯著降低，但由于復合配方的攝入得到顯著恢復。標記輔助性T細胞的CD3+、CD4+、CD8-比例，對比空白組，模型組顯著降低；對比模型組，復合配方組顯著升高(圖3-b)。標記細胞毒性T細胞的CD3+、CD4-、CD8+比例，對比空白組，模型組有降低趨勢但無顯著差異；復合配方組對比空白組和模型組未見顯著差異(圖3-c)。

以上結果表明鋅加VC復合配方通過抑制輔助性T細胞的減少，緩解了環磷酰胺誘導的脾臟T細胞減少。

a-CD3+比例；b-CD3+、CD4+、CD8-比例；c-CD3+、CD4-、CD8+比例圖3 鋅加VC復合配方對脾臟T細胞含量的影響Fig.3 The effect of zinc and VC compound formula on T cells content in immature mice spleen

2.4 鋅加VC復合配方對脾臟NK細胞活性的影響

如圖4所示，與空白組比較，復合配方組和模型組的脾臟NK細胞的活性顯著下降，且復合配方組和模型組之間無顯著性差異。

以上結果表明鋅加VC復合配方未能有效逆轉環磷酰胺誘導的NK細胞活性降低。

圖4 鋅加VC復合配方對幼齡小鼠脾臟NK細胞活性的影響Fig.4 The effect of zinc and VC compound formula on NK cells activity in immature mice spleen

2.5 鋅加VC復合配方對腸道B細胞功能的影響

腸道中B細胞重要的生發中心派氏結的數量如圖5-a所示，對比空白組，模型組顯著減少；對比模型組，復合配方組顯著增多。表明B細胞功能的溶血空斑數于模型組顯著降低，由于復合配方的攝入顯著回升(圖5-b)。維持腸道黏膜穩態的重要物質SIgA同樣在模型組顯著降低，但由于復合配方的攝入得到部分回升(圖5-c)。

以上結果表明鋅加VC復合配方有效抑制了環磷酰胺造成的腸道B細胞功能障礙。

圖5 鋅加VC復合配方對腸道B細胞功能的影響Fig.5 The effect of zinc and VC compound formula on B cells function in immature mice intestine

2.6 鋅加VC復合配方對淋巴細胞增殖的影響

外周血淋巴細胞增殖如圖6所示，對比空白組，模型組和復合配方組顯著降低，且模型組和復合配方組未見顯著差異。

以上結果表明鋅加VC復合配方未能逆轉環磷酰胺誘導的外周血淋巴細胞增殖障礙。

圖6 鋅加VC復合配方對淋巴細胞增殖的影響Fig.6 The effect of zinc and VC compound formula on proliferation ability of lymphocytes in immature mice serum

3 結論與展望

3.1 結論

鋅和VC在自然界中分布廣泛，工業生產成熟、成本低廉，并且二者功能繁多，因此作為營養補充劑的重要功效成分被廣泛應用。然而，將鋅與VC聯用以抵抗兒童青少年發育期間的免疫力低下，目前還未發現相關研究。本研究首次發現鋅加VC復合配方具有逆轉環磷酰胺誘導的幼齡小鼠免疫力低下的作用。

環磷酰胺是一種廣泛應用于各種癌癥治療的臨床化療藥物，也是一種免疫抑制的誘導劑，可以通過破壞脾臟和胸腺功能來誘導免疫抑制。胸腺是T細胞分化場所，胚胎時期開始形成，出生后完成分化，于青春期達到活動高峰，之后開始萎縮，因此青春期是胸腺發育，建立T細胞庫的重要時期。本研究結果顯示鋅加VC復合配方顯著逆轉了環磷酰胺誘導的幼齡小鼠胸腺萎縮。T細胞分化成熟后經循環系統分布至外周免疫器官。其中Th1和Th2細胞分泌的不同類型的細胞因子是決定細胞功能的重要因素。Th1細胞分泌IL-2、TNF-α和IFN-γ，參與細胞免疫應答[20-21]。IFN-γ是一種天然免疫介質，通過激活單核/巨噬細胞促進主要組織相容性復合配方分子的表達[22-23]。IL-2由活化的T淋巴細胞產生，可誘導未成熟T細胞的生長、增殖和分化為效應T細胞[24]。TNF-α由T細胞、B細胞、NK細胞和巨噬細胞產生，通過抑制細菌感染和抑制急性應激來調節炎癥和宿主防御[25]。我們的研究結果發現外周血中Th1分泌的細胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ含量也由于鋅加VC復合配方的攝入恢復至接近正常水平。然而由Th2細胞分泌的細胞因子IL-4并未由于攝入復合配方而得到恢復。Th1和Th2細胞均是由前體細胞Th0極化而來，Th0細胞受某一種亞群極化受細胞因子、抗原種類及濃度、抗原呈遞細胞(antigen-presenting cells，APC)類型等多種因素的影響[26]。有文獻報道，鋅可以通過上調Th1細胞分泌細胞因子，增強Th1細胞應答，并促進Th0向Th1極化[11]。還有研究表明IFN-γ可以活化巨噬細胞為專職APC，當巨噬細胞為專職APC時，會促進Th0向Th1極化。與此同時IFN-γ還可以通過抑制IL-4的表達，抑制Th0向Th2極化[27]。因此我們推測有可能是由于復合配方介導IFN-γ促進了Th0向Th1的極化，并抑制了IL-4的分泌。當IL-2、IFN-γ細胞因子上調時會加速抗原向T細胞呈遞，激活CD4+T細胞。與此相對應，本研究的結果證明了鋅加VC復合配方通過逆轉環磷酰胺誘導的脾臟中CD3+T細胞和CD4+T細胞比例的減少，使脾臟輔助型T細胞數量顯著回升。因此，我們推測鋅加VC復合配方通過促進Th1細胞的免疫應答，逆轉環磷酰胺誘導的免疫抑制。

除了輔助型T細胞以外，細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)和NK細胞是存在于脾臟中參與早期免疫應答的2種主要淋巴細胞，CTL細胞和NK細胞被細胞因子和趨化因子激活，在調節腫瘤生長和轉移以及消除病毒[28]中發揮核心作用。我們的實驗結果顯示鋅加VC復合配方對緩解環磷酰胺造成的脾臟CTL細胞數量減少和NK細胞活性降低均無顯著的影響。有研究報道人體在攝取500 mg/d VC的條件下會有效提升體內CTL細胞數量和NK細胞活性[29]，在我們的實驗中，每只小鼠每天攝入VC的含量為50 mg/kg，相當于人類250 mg/d，因此我們推測CTL細胞數量及NK細胞活性的恢復有可能依賴于VC的攝取量。

腸道黏膜免疫系統是一個結構獨立、功能復雜的免疫網絡。派式結是腸道B細胞的生發中心，聚集了大量的活化B細胞，涵蓋了人體近80%的漿母細胞和漿細胞，生成大量的SIgA[30]。IgA是人體內含量最多的免疫球蛋白，有著中和毒素、細菌或病毒，補體活化的作用。近年來，大量研究報道，天然提取物可通過促進IgA、IgM和IgG的產生來增強體液免疫[31]。我們的結果表明，鋅和VC復合配方可以提高環磷酰胺誘導的免疫抑制小鼠B細胞的活性，同時提升腸道SIgA含量。這一結果表明鋅和VC復合配方在增強體液免疫應答中發揮了作用。

成熟血細胞如白細胞、紅細胞和血小板是由造血干細胞產生的，這些造血干細胞具有多能性和自我再生能力。有研究表明環磷酰胺降低了白細胞、中性粒細胞數量，殺傷增殖期的淋巴細胞，減少循環系統中的淋巴細胞數目。本研究結果發現，環磷酰胺治療降低了外周血中淋巴細胞的增殖，與之前報道一致[32]。但鋅加VC復合配方攝入后淋巴細胞的增殖能力并未得到顯著恢復。在今后的實驗規劃中，我們將檢測外周血中紅細胞、白細胞、血小板、中性粒細胞數量以及骨髓紅細胞、中性粒細胞、巨核細胞的數量，以明確此鋅加VC復合配方是否對環磷酰胺誘導的骨髓抑制有影響。

綜上所述，我們的結果初步驗證了鋅加VC復合配方通過促進Th1細胞的免疫應答和提升腸道B細胞功能，增強體液免疫應答逆轉由環磷酰胺誘導的免疫抑制(圖7)。

圖7 鋅加VC復合配方逆轉環磷酰胺誘導的免疫抑制示意圖Fig.7 The schematic of reversion of cyclophosphamide-induced immunosuppression by zinc and VC compound formula

3.2 展望

提升兒童免疫力，綜合強化兒童及青少年的身體健康素質一直是為社會所聚焦的公共衛生問題。上海交通大學醫學院兒童醫學中心童世廬團隊對2 143例新冠肺炎患兒進行統計研究，結果表明中度患者占38.8%，兒童重癥和危重癥的病例為5.9%。除了疫情的影響，許多難民兒童也長期面臨著生活衛生條件差、營養不良、傳染性疾病、疫苗接種活動推遲等一系列災難性健康影響。因此開發一種價格低廉，可以大規模生產的營養補充劑以提高兒童的基礎免疫力可以在一定程度上緩解社會醫療壓力，為兒童的健康提供保障。因此為開發切實有效的可以提高免疫力的營養補充劑提供充分的理論依據，對于實現全球性健康是至關重要的。